假酸浆多糖提取纯化工艺的研究

姜 盼，王 遂，齐欣欣

(哈尔滨师范大学化学化工学院，哈尔滨150025)

假酸浆籽又称为木瓜籽，为茄科植物假酸浆的成熟籽种.该植物主要分布于云南、贵州、广西等地区，生长于田边、荒地和房屋周围，有野生也有种植.其全草可以入药，具有镇静、祛痰、清热、解毒等功效，其籽种也具有清热、退火、利尿等功能，在民间广泛用来制作冷饮食品“冰木瓜”或称“冰凉粉”“冰粉”等，其外观为一浅黄色凝胶状物，加人辅料和冰等制成一种老少皆宜的解暑、止渴的小吃[1].

植物多糖是由许多相同或不同的单糖以α－或β－糖苷键所组成的化合物，普遍存在于自然界植物体中.多糖是一切有机体必不可少的成分，它与维持生命的种种生理机能有着密切的联系.有些植物多糖在降血糖、抗肿瘤、抗衰老等方面具有独特的生理活性且具有无毒、副作用小的优点[2－4].本实验比较了热水浸提法、超声波提取法、微波提取法在提取假酸浆多糖方面的差异，确定了最佳的提取条件.对多糖浓缩液进行纯化，得到了最佳的纯化条件.

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 原料与试剂

假酸浆籽(景东银生农副产品有限公司);苯酚、浓硫酸、无水乙醇、盐酸、三氯乙酸(TCA)、氯仿、正丁醇、磷酸、氢氧化钠、过氧化氢(均为分析醇);葡萄糖标准品、牛血清蛋白、考马斯亮蓝G－250.

1.1.2 主要仪器与设备

752－紫外可见分光光度计(上海光谱仪器有限公司)、HC－2064离心机(科大创新股份有限公司中佳分公司)、R－250旋转蒸发器(上海申胜生物有限公司)、SHB－IIIA循环水式多用真空泵(郑州长城科工贸有限公司)、植物组织捣碎机(天津市泰斯特仪器有限公司)、KQ2200－DB型数控超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)、WD900型微波炉(顺德市格兰仕电器实业有限公司)、SHA－C水浴恒温震荡器(上海医疗器械五厂).

1.2 方法

1.2.1 标准曲线的绘制

1)葡萄糖标准曲线的绘制苯酚－硫酸法[5]

应用苯酚－硫酸法测定多糖的含量，葡萄糖为标准品，以葡萄糖质量浓度为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制标准曲线如图1所示.

图1 葡萄糖标准曲线

图2 蛋白质标准曲线

2)蛋白质标准曲线的绘制

采用考马斯亮蓝法测定蛋白质含量，牛血清蛋白为标准品.以牛血清蛋白质量浓度为横坐标，吸光度为纵坐标绘制标准曲线如图2所示.

1.2.2 假酸浆多糖的提取

1)提取工艺流程[6]

提取工艺:假酸浆籽→粉碎→配成一定液固比→提取(热水浸提、超声波提取、微波提取)→抽滤→得到多糖溶液

2)热水浸提法的单因素试验[7－8]和正交试验

分别称取1 g粉碎好的假酸浆6份，放入6只烧杯中，按固液比1∶25，90℃水浴加热1 h，然后进行真空抽滤.固定其他条件，分别考察料液比(1∶15～1∶65)、提取时间(0.5 ～5.5 h)、提取温度(50～100℃)对多糖得率的影响.

在单因素试验的基础上，选择料液比、提取时间、提取温度等进行正交试验，每个因素设3个水平(见表1).

表1 正交试验因素水平表

3)超声波提取法的单因素试验和正交试验

分别称取1 g粉碎好的假酸浆5份[9－11]，放入5只烧杯中，按固液比1∶50，超声波功率70 W，超声温度60℃，超声处理30 min，然后进行真空抽滤.固定其他条件，分别考察料液比(1∶20～1∶66)、超声波功率(50～90 W)、超声温度(50～70℃)、超声时间(10～50 min)对多糖得率的影响.

在单因素试验的基础上，选择料液比、超声波功率、超声时间、超声温度等进行正交试验，每个因素设3个水平(见表2).

表2 正交试验因素水平表

4)微波提取法的单因素试验和正交试验

分别称取 1 g粉碎好的假酸浆 5 份[12－13]，放入5只烧杯中，按固液比1∶30，微波功率中低火，微波处理2 min，然后进行真空抽滤.固定其他条件，分别考察料液比(1∶20～1∶60)、微波功率(低火～高火)、微波时间(1～5 min)对多糖得率的影响.

在单因素试验的基础上，选择料液比、微波功率、微波时间等进行正交试验，每个因素设3个水平(见表3).

表3 正交试验因素水平表

1.2.3 假酸浆多糖的纯化

1)乙醇沉淀工艺

取提取所得的多糖浓缩液 10 mL[14]，加入无水乙醇，搅拌均匀后静置，沉淀物经抽滤干燥后称重.固定其他条件不变分别考察乙醇沉淀时间(1～7 h)、无水乙醇用量(30% ～80%)对多糖得率的影响.

2)脱蛋白工艺

(A)TCA法

在多糖水提液中滴加与多糖水提液等体积的三氯乙酸(三氯乙酸的体积分数一般控制在5% ～10%)混匀后静置过夜，离心.除去胶状沉淀重复以上操作直至溶液不再混浊为止[15－16].得到无蛋白的多糖.

(B)盐酸法

往多糖浓缩液中加入盐酸，调节pH值至3.0，静置过夜.3 500 r/min，15 min去除部分沉淀得脱蛋白液.

(C)Sevag法

将氯仿按浓缩液1/5体积加入，随之再加入氯仿体积1/5的正丁醇，混合物剧烈振荡20 min.分出水层和有几层交界处的变性蛋白质.重复上述操作，直至无变性蛋白质出现.测定上清液多糖质量浓度和蛋白质质量浓度.

3)过氧化氢脱色单因素试验和正交试验

从100 mL 多糖溶液中吸取 8 mL[17－18]，滴加2～6滴氨水，将pH值调至8～9，加入1 mL30%的过氧化氢，50℃下脱色4 h，过滤并定容至10 mL.分别考察温度(30～60)、脱色时间(1～6 h)、过氧化氢加入量(1～5 mL)对假酸浆多糖脱色效果的影响[19].

在单因素试验的基础上，选择料液比、超声波功率、超声时间、超声温度等进行正交试验，每个因素设3个水平(见表4).

表4 正交试验因素水平表

2 结果与分析

2.1 结果

不同的提取方法正交试验结果见表5.

表5 不同的提取方法正交试验结果以及分析表

续表

通过分析可知，三种不同的提取方法(热水浸提法、超声波提取法、微波提取法)提取假酸浆多糖的得率是不同的.由单因素试验和正交试验确定了最优的提取方法是热水浸提法，提取条件为料液比1∶55、温度80℃、时间3 h、提取2次，在此条件下提取率可达6.18%.热水浸提法得到的多糖质量浓度高但是该方法操作时间长，费时废料.超声波提取法提取率比热水浸提法低，这可能是超声波有较强的剪切作用，长时间的作用会使大分子的多糖化学键断裂，从而在后处理的过程中使损失增大而影响多糖的得率.微波法提取假酸浆多糖的得率最低，这可能是因为微波在处理时导致假酸浆多糖降解.

2.2 乙醇沉淀假酸浆多糖单因素试验结果

2.2.1 乙醇沉淀静置时间对假酸浆多糖得率的影响

如图3，通过分析可知，乙醇沉淀静置时间越长，多糖的得率先是逐渐增大，到4 h时达到最大值，超过4 h后多糖的得率反而下降.这可能是由于多糖组成中有多羟基的醛和酮，当沉淀静置时间过长时，其分子中的羟基会与乙醇分子中的羟基形成互溶体系，从而使得多糖的沉淀质量有所减少.

图3 乙醇沉淀静置时间对多糖得率的影响

2.2.2 无水乙醇加入量对假酸浆多糖得率的影响

通过分析图4可知，随着无水乙醇加入量的逐渐升高，多糖的得率逐渐增大.这可能是因为在低体积分数乙醇溶液中相对分子质量较小的多糖不能被沉淀下来，随着无水乙醇用量的增多，多糖的沉淀质量逐渐增加.

由单因素试验确定的最佳的醇沉条件为无水乙醇加入量为80%，醇沉时间为4 h，在此条件下对假酸浆多糖进行醇沉试验，醇沉后的多糖体积分数可达44.5%.

图4 无水乙醇加入量对多糖得率的影响

2.3 脱蛋白质的方法比较

由图5可知，三种方法对多糖提取液脱蛋白的效率存在着明显的差异.三种方法蛋白质脱除率由大到小的是Sevag＞TCA法＞盐酸法.三种方法中多糖损失率由低到高的是TCA法＞Sevag法＞盐酸法.由此可见盐酸法脱蛋白的效果最差，而且多糖的损失率高.这可能是因为盐酸为强酸，试验条件不好控制，若试验条件控制不当，则多糖的损失率严重.TCA法相对于盐酸法脱蛋白的效果好，而且多糖的损失率也比盐酸法小.Sevag法脱蛋白的效果最好，

但是多糖的损失率相对TCA法要大.根据实验室的条件，以及时间、经济的考虑最后确定TCA法为去除假酸浆多糖蛋白质的最佳方法.在此条件下脱蛋白率可达70.8%.

图5 脱蛋白质的方法比较

2.4 过氧化氢脱色的结果

过氧化氢脱色的正交试验结果结果见表6.

表6 过氧化氢脱色的正交试验结果

通过表6分析可知最佳的脱色工艺为温度50℃、时间2 h、过氧化氢加入量为2 mL，在此条件下下脱色率可达91.0%.

3 结论

1)本研究比较了热水浸提法、超声波提取法、微波提取法对提取假酸浆多糖得率的影响.确定了最佳的提取工艺为水提法，在此条件下提取率可达6.18%.超声波提取法用于假酸浆多糖的提取方面虽然多糖得率不如热水浸提法高，但是超声波法有着时间短的优点，适合用于工业生产.

2)本研究对假酸浆多糖进行了醇沉工艺、去蛋白工艺、过氧化氢脱色工艺.确定了最佳的纯化条件.在最佳的纯化条件下，醇沉后的多糖含量可达80.5%，蛋白质脱除率可达70.8%.脱色率可达91.0%.

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