卵母细胞培养时间对单精子胞浆内注射胚胎质量及妊娠结局影响

乜照燕吴海峰张 娜甄秀丽张 轶郭丽娜赵素英. 河北医科大学第四医院（石家庄 0500）; . 河北省胸科医院

卵母细胞培养时间对单精子胞浆内注射胚胎质量及妊娠结局影响

乜照燕1*吴海峰2张 娜1甄秀丽1张 轶1郭丽娜1赵素英1
1. 河北医科大学第四医院（石家庄 050011）; 2. 河北省胸科医院

摘要目的 探索单精子卵胞浆内注射（ICSI）前最适合的卵母细胞体外培养时间，即取卵结束到开始ICSI的时间（t），以利于取得高的受精率、优质胚胎率和良好的妊娠结局。方法 根据卵母细胞体外培养时间，将患者分为 3 组：A 组为2 h＜t＜4 h，（n =174），B 组为4 h＜t＜6 h，（n =147），C 组为t≥6 h，（n =82）。回顾性分析卵母细胞体外培养时间对ICSI 患者的受精率、卵裂率、优质胚胎率及临床结局的影响。结果 （1）A组与B组受精率（81.5% vs 83.5%）、卵裂率（98.9% vs 97.5%）、优质胚胎率（46.9% vs 45.5%）、植入率（36.7% vs 32.8%）、妊娠率（55.2% vs 51.7%）及流产率（12.5% vs 13.2%）比较差异均无统计学意义（P＞0.05）。（2）C组受精率（88.3%）显著高于A 组和B组，差异有统计学意义（P＜0.05）。C组优质胚胎率（41.6%）、植入率（18.7%）、妊娠率（30.7%）均低于A 组和B组，差异有统计学意义（P＜0.05）。C组卵裂率（98.9%）、流产率（12.0%）与A组和B组比较差异均无统计学意义（P＞0.05）。结论 过长卵母细胞体外培养时间（≥6 h）可以有高的受精率，但优质胚胎率降低，不利于改善 ICSI 患者的临床结局；卵母细胞体外培养2～6h后进行ICSI可以获得较为理想的临床结局。

关键词卵母细胞; 体外受精; 精子注射, 细胞质内; 胚胎发育

单精子胞浆内注射（intracytoplasmic sperm injection，ICSI）已经广泛地应用于辅助生殖领域，成为治疗男性不育的重要方法。但取卵后何时进行ICSI是最佳的授精时机，至今尚无共识性的标准化操作程序（SOP ），不同实验室在授精时机操作上存在差异， 这些差异是否会导致妊娠结局的不同?目前的研究尚未得到统一的标准。本研究回顾性分析了卵母细胞体外培养时间对于 ICSI 患者的受精、胚胎发育以及临床结局的影响，以期探索最适合的 ICSI时机。

资料与方法

一、研究对象

研究对象为 2012 年1 月至2013年12月在河北医科大学第四医院接受ICSI 治疗的患者。患者的入选标准为：患者由于单纯男方因素行ICSI 治疗，女方年龄≤35 岁，基础内分泌正常。根据从患者取卵结束到开始进行 ICSI 的时间（t），将患者分为 3 组：A 组（2 h≤t＜4 h，n =174），B 组（4 h≤t＜6 h，n =147），C 组（≥6 h，n =82）。

二、控制性促排卵

采用长方案控制性超排卵，于排卵后第7天给予醋酸曲普瑞林0.1mg （商品名：达必佳，0.1mg/支，德国辉凌制药有限公司，注册证号：H20100365）皮下注射，第14天左右给予注射用重组人促卵泡激素（FSH）150～225IU（商品名：果纳芬，75IU/支，瑞士默克雪兰诺有限公司，注册证号：S20080030） 启动促排卵，当主导卵泡中有1个直径达18 mm或2个达17 mm或3个达16mm，雌激素达到每个卵泡约200～300 pg/mL，给予注射用重组人绒促性激素（HCG）250 μg（商品名：艾泽，250μg /支，瑞士默克雪兰诺有限公司，注册证号：S20110045），36～37 h后取卵，取卵当天为D0。将获取的卵冠丘复合物 （oocyte- coronacumulus complex）转移到 G- IVF 培养基中培养。

三、显微注射

实施显微注射前1h去除颗粒细胞，先将卵子置于预热的含80～100IU/mL透明质酸酶的G-Mops培养液中连续吹打数次，控制在1min以内，然后将其吸出置于G-Mops培养液中，换用内径稍大于卵子的毛细玻璃管继续吹打，直到完全去除颗粒细胞。将卵子移至G-IVF培养液中等待授精，注射前先在倒置显微镜下观察卵子的质量及成熟度，观察卵胞浆内是否有空泡或其他畸形并记录。注射时将第一极体置于11点处，避免注射过程对卵母细胞纺锤体的损伤。注射时尽可能少的注入PVP液。最后将注射后的卵子用培养液冲洗后置GM皿中培养。

四、受精观察和胚胎评估

使用 G5 系列培养系统进行胚胎体外培养（瑞士 Vitrolife 公司）。受精后 16～18 h（第 1 天）根据Scott 的原核评分标准[1]对卵母细胞的受精情况进行评估， 第 3 天对胚胎卵裂球数目、形态以及碎片比例进行评估。达到以下标准的为优质胚胎：（1）胚胎卵裂球数目＞6 个细胞，卵裂球形态基本对称且有折光性；（2）胚胎碎片比例≤20%。胚胎移植采用G-2培养基。所有培养基均添加 5%人血清白蛋白（HSA）。

五、胚胎移植

在第3天，选择好移植的胚胎转移至Falcon 3037培养皿的内孔培养液（含10%HSA的G-2培养液）中，放入培养箱中待用。一般移植2个胚胎。将胚胎装载在含25～30μl移植培养液的导管内，两端被两段10 μl的气体隔开。吸好移植液及胚胎的导管立即送到手术室中，待导管插入宫腔内后，将胚胎与移植液（约30μl）注入宫腔内。移植后，将导管送回培养室，反复冲洗导管，解剖镜下仔细观察是否有胚胎遗留。如果有胚胎遗留，则应尽快通知临床医生，并且必须用一根干净的移植管重新移植。所有患者于取卵当日起予黄体酮60 mg/d 进行黄体支持。

六、妊娠确认

移植后常规黄体支持，14 d 测定血清β-HCG＞10 IU/L为生化妊娠， 2 周后行阴道超声检查， 提示宫内有孕囊者判定为临床妊娠，并计算种植率（种植率=孕囊数/移植胚胎数×100%）。移植后3 个月 B 超随访有胎心搏动者为继续妊娠，无胎心搏动者为早期流产，计算流产率。

七、统计学分析

数据统计学分析采用SPSS 13.0软件，数据用x±s表示，计数资料采用卡方检验，多样本率两两比较的卡方分割法，计量资料采用单因素方差分析，两两比较采用LSD法，以P＜0.05为差异有统计学意义。

结 果

一、3组患者女方基本情况比较

3组患者在女方年龄、不孕年限、体质量指数、基础FSH水平、基础窦卵泡数等方面的差异无显著性（P均＞0.05），见表1。

二、3组患者控制性超排卵情况比较

在控制性超排卵中，3组患者促性腺激素（Gn）天数、Gn用量、HCG日雌二醇（E2）水平、HCG日子宫内膜厚度、平均获卵数、移植胚胎数均无统计学意义（P＞0.05），见表2。

三、卵母细胞体外培养时间对 ICSI CSI 患者卵母细胞成熟、受精以及胚胎体外发育的影响

C组卵母细胞的成熟卵子率高于 A 组及B 组，差异无统计学意义（P＞0.05）。C组受精率高于A 组及B 组，差异有统计学意义（P＜0.05）。C组优质胚胎率、植入率、妊娠率低于A组和B组，差异有统计学意义（P＜0.05）。C组卵裂率、流产率与A组和B组比较差异无统计学意义（P＞0.05），见表3。

表1 3组患者女方基本情况比较

表2 3组患者控制性超排卵情况比较

表3 卵母细胞体外培养时间对胚胎发育以及临床结局的影响

讨 论

ICSI 是在体外显微镜下将单个精子直接注入成熟卵母细胞胞质内，使精、卵结合的一种显微操作技术。该技术主要应用于男性因素不育， 成为男性严重少弱精子症、畸形精子症及阻塞性无精子症的有效治疗方法。在辅助生殖治疗过程中，注射 HCG 后 36～37 h取卵，控制性卵巢刺激（controlled ovarian stimulation，COS）人工干预措施使卵子成熟状态不同步，取卵后何时为进行ICSI的最佳授精时机，至今尚无共识性的标准化操作程序（SOP），不同实验室在授精时机操作上存在差异，普遍认为刺激周期取卵后短时间的体外培养有助于卵子核和胞浆的进一步成熟，预培养有助于胞浆的进一步成熟，但卵子应存在一个适宜的受精时机，受精时间是决定胚胎优良与否的一个重要因素。2001年Jacobs等[2]在对881例体外受精周期获卵后预培养时间与临床结局相关性研究中发现，卵母细胞在受精前不同时间间隔的预培养，1～2h、2～3h、3～4h、4～5h以及大于5h受精率与胚胎质量相近，有研究[3]认为卵母细胞体外培养时间（4～8 h）有利于改善 ICSI 患者的临床结局。Falcone等[4]研究发现ICSI之前的最适当的温育时间为5～6h。而另一些研究则认为不同培养时间对妊娠结局无影响[2, 4]。对于卵母细胞体外培养时间对 ICSI 结局的影响，各个研究的结果不尽相同。取卵后卵子培养时间以及授精时间在不同的实验室并不相同。为了探明IVF-ET中取卵后卵子培养时间与胚胎质量的相关性，该文分析了3个时段授精后的相关临床资料，旨在为临床提供相关的基础数据。

本研究从去除颗粒细胞到行 ICSI 操作总的时间是一致的，均在去除颗粒细胞1h后实施显微注射。在本研究中，A 组及B 组在成熟卵子率、受精率、卵裂率以及优质胚胎率等胚胎早期发育指标上差异并无显著性，C组成熟卵子率高于 A 组及B 组，这可能是随着体外培养时间的延长，部分MⅠ期卵子发育至MⅡ期，达到细胞核的成熟。在体外，卵母细胞质的成熟往往迟于细胞核的成熟，尽管无法直接评估，笔者推测：一方面C 组的胞质成熟程度可能低于A组和 B组，而细胞质的成熟度必然与之后的胚胎发育密切相关，只有胞浆成熟的卵子内线粒体的能量才可推动胚胎的发育，达到卵裂球发育的同步化，成为优质胚胎[5, 6]，这部分卵子即使可以受精，胚胎质量可能不佳；另一方面，卵母细胞质量的好坏将直接影响卵细胞的受精率、受精卵的卵裂率、早期胚胎的存活、妊娠的建立和维持，高质量卵子具有较高的受精率、卵裂率及优质胚胎率[7, 8]，本研究中C组随着体外培养时间延长，本来已经成熟的卵母细胞趋于老化，错过了最佳的授精时间。以上两个方面可能是导致C组患者优质胚胎率下降的原因，胚胎质量降低从而导致一系列后续影响，植入率降低、妊娠率降低。

本研究的结果显示，卵母细胞在体外培养 2～6 h后进行 ICSI，卵母细胞的成熟度均维持在较理想的水平，可以获得较为理想的临床结局；6 h 以后虽然可以获得更高的受精率， 但优质胚胎率、植入率、妊娠率有不同程度的降低， 目前，各中心所采用的促排卵方案、HCG注射时机、体外培养环境等因素均难以等同，这也是导致研究结果不尽相同的主要原因。每个实验室都在不断的改进、优化自己的SOP， 其目标只有一个：最大限度的维持配子/胚胎固有的发育潜能，以期获得最好的胚胎质量和最高的妊娠率。

参 考 文 献

1 Scott L, Alvero R, Leondires M, et al. The morphology of human pronuclear embryos is positively related to blastocyst development and implantation. Hum Reprod 2000; 15(11): 2394- 2403

2 Jacobs M, Stolwijk AM, Wetzels AM. The effect of insemination/ injection time on the results of IVF and ICSI. Hum Reprod 2001; 16 (8): 1708-1713

3 顾亦凡, 陆长富, 龚斐, 等. 卵母细胞体外培养时间对单精子胞浆内注射临床结局的影响. 中国现代医学杂志2010; 20(22): 3364-3367

4 Falcone P, Gambera L, Pisoni M, et al. Correlation between oocyte preincubation time and pregnancy rate after intracytoplasmic sperm injection. Gynecol Endocrinol 2008; 24(6): 295-299

5 Isiklar A, Mercan R, Balaban B, et al. Impact ofoocyte pre-incubation time on fertilization, embryo quality and pregnancy rate after intracytoplasmic sperm injection. Reprod Biomed Online 2004; 8(6): 682-686

6 Strassburger D, Friedler S, Raziel A, et al. The outcome of ICSI of immature MI oocytes and rescued in vitro matured MII oocytes. Hum Reprod 2004; 19 (7): 1587-1590

7 Balaban B, Urman B. Effect of oocyte morphology on embryo development and implantation. Reprod Biomed Online 2006; 12(5): 608-615

8 Wilding M, Di Matteo L, D'Andretti S, et al. An oocyte score for use in assisted reproduction. J Assist Reprod Genet 2007; 24(8): 350-358

（2014-08-15收稿）

doi:10.3969/j.issn.1008-0848.2015.01.006

中图分类号R 321-33

*通讯作者, E- mail: niezhaoyan@163.com

Effects of oocyte preincubation time on embryo quality and clinical outcomes after intracytoplasmic sperm injection

Nie Zhaoyan1*, Wu Haifeng2, Zhang Na1, Zhen Xiuli1, Zhang Yi1, Guo Lina1, Zhao SuYing11, The Fourth Affi liated Hospital of Hebei Medical University, Shijiazhuang 050011, Hebei, China;
2. Chest Hospital of Hebei Province
Corresponding author: Nie Zhaoyan, E- mail: niezhaoyan@163.com

AbstractObjective Explore the most suitable cytoplasmic sperm injection (ICSI) timing for achieving a high fertilization rate, good quality embryo rate and good outcome of pregnancy. Methodsthods According to the oocyte preincubation time (t) defi ned form the end of the time of egg retrieved to the beginning time for ICSI (T), the patients were divided into three groups including group A (2 h≤t ＜4 h, n = 174), group B (4 h≤t ＜6 h , n = 147), and group C (≥6 h, n = 82). A retrospective analysis was carried out about the effcets f the oocytes incubation time on ICSI patients fertilization rate, cleavage rate, high-quality embryo rate and clinical outcome. Resultssults (1) There were no signifi cant differences in fertilization rate (81.5% vs 83.5%), cleavage rate (98.9% vs97.5%), high-quality embryo rate (46.9% vs45.5%), implantation rate (36.7% vs32.8 %), pregnancy rate (55.2% vs551.7%) and abortion rates (12.5% v13.2%) between Group A and group B (P＞0.05). (2) Fertilization rate in Group C (88.3%) was signifi cantly higher than that in group A and group B(P＜0.05). High quality embryo rate (41.6%), implantation rate (18.7%), pregnancy rate (30.7%) in Group C were all lower obviously than those in group A and group B (P＜0.05). Cleavage rate (98.9 percent), abortion rate (12.0%) in group C had no signifi cantdifferences as compared with that of the other two groups (P＞0.05). Conclusionusion Prolonging preincubation time (≥6 h) may have a high fertility rate, and lower quality embryos, which may tamper clinical outcome of ICSI patients.

Key wordsords oocytes; in vitro; sperm injections, intracytoplasmic; embryonic development