不同产地龙葵药材的高效液相色谱－蒸发光散射检测指纹图谱

王 珏， 金一宝， 王铁杰， 李晓帆

（1.深圳市药品检验所，深圳药品质量标准研究重点实验室，广东 深圳518057；2.深圳大学，深圳市微生物基因工程重点实验室，广东深圳518060）

龙葵是茄科植物龙葵Solanum nigrum L.的干燥地上部分［1］。其性寒、味苦、微甘、有小毒，具有清热解毒、消肿散结、活血化瘀、利水消肿、止咳祛痰的功效［2］。现代临床医学上广泛用于感冒、牙痛、皮肤瘙痒症、慢性支气管炎、急性肾炎等炎症治疗［3-5］。近期研究发现龙葵具有很好的抗肿瘤活性［6］，国内外学者的研究报道主要集中在皂苷类成分［7］和甾体生物碱类成分［8］等具有抗肿瘤活性的物质。龙葵药材生长范围极其广泛，采集来源基本涵盖我国大部分产区［9］，不同地区的种质药用成分含量差别很大。WHO《草药评价原则》［10］以及FDA《植物药研制指南》［11］均提出植物药疗效作用的物质基础是药物的整体成分，任何一种或几种活性成分均不能代表药物的整体。在植物药制品的临床前研究资料中，利用指纹图谱等分析方法来评价植物药品的一致性和稳定性［12］。中药色谱指纹图谱能较好地体现中药成分的复杂性和相关性，因此本文对不同产地来源的龙葵药材进行了指纹图谱研究，获得了在蒸发光散射检测器下非挥发性成分的指纹图谱。结果显示，不同来源的龙葵之间有显著的差异性，利用其指纹图谱可以很好地实现分类。该研究可作为龙葵药材的参照指纹图谱，从而进一步完善龙葵药材的质量标准。

1 实验部分

1.1 药材

不同产地的龙葵药材共34批，具体采集地点见表1。龙葵药材由沈阳药科大学吴维春老师鉴定均为Solanum nigrum L.的干燥地上部分。

1.2 仪器与试剂

高效液相色谱仪（日本岛津株式会社，SEDEX MODEL 75，二元梯度泵LC-10ATVP），色谱柱选用Phenomenex C18（250 mm ×4.6 mm，5 μm）。色谱级甲醇（天津科密欧化学试剂有限公司），色谱级乙腈（迪马公司），色谱级三乙胺（Fisher Scientific），蒸馏水，无水乙醇（分析纯，天津市永大化学试剂有限公司）。

1.3 色谱条件

Phenomenex C18（250 mm ×4.6 mm，5 μm），流速 1.0 mL／min，流动相 A 相为乙腈（含0.03% （v／v）三乙胺），B 相为20% （v／v）甲醇水溶液（含0.03% （v／v）三乙胺），二元线性梯度洗脱（洗脱程序：0～10 min，A相由10%升至15%；10～15 min，A相由15%升至30%；15～30 min，A相由30%升至34%；30～52 min，A相由34%升至50%；52～55 min，A相由50%升至55%），柱温25℃，蒸发光检测器蒸发管温度40℃，进样量20 μL。

1.4 样品制备

1.4.1 供试品溶液的制备

取干燥的龙葵药材，粉碎后过2号筛，再真空干燥12 h，取药材粉末2份，每份2.0 g，精密称定。加60% （v／v，下同）乙醇水溶液20 mL，超声提取2次，每次20 min。过滤，合并滤液，滤液减压浓缩至近干，用60%乙醇水溶液转移至25 mL容量瓶中，加60%乙醇水溶液定容，摇匀，微孔滤膜（0.45 μm）过滤，取续滤液作为供试品溶液。

表1 龙葵药材产地及采集时间Table 1 Sources and collection times of Solanum nigrum L.raw herbs

1.4.2 对照品溶液

分别称取适量前期研究中分离得到的12个对照品［13］（结构式见图1），精密称定，加60% 乙醇溶解制成一定浓度的对照品溶液，用于色谱峰的归属。

图1 对照品的结构式Fig.1 Structural formula of standard samples

图1 （续）Fig.1 （Continued）

2 结果与讨论

2.1 色谱条件考察

2.1.1 色谱柱

在同样的流动相条件下，用3种不同品牌的色谱柱分别分析同一个样品。通过色谱图的比对发现UltimateTM和SHIMADZU柱的分离效果明显不及Phenomenex柱（见图2）。由此本试验选择Phenomenex C18（250 mm ×4.6 mm，5 μm）柱。

2.1.2 流动相洗脱程序

考察了不同的流动相系统，主要有乙腈-水（等度）、乙腈-水（梯度）、乙腈-水（均含0.03% 三乙胺，梯度）以及乙腈-甲醇-水（均含0.03%三乙胺，梯度）。结果表明：使用含0.03%（v／v）三乙胺的乙腈-20%（v／v）甲醇水溶液系统，二元线性梯度洗脱，各成分峰形尖锐，分离度良好，各主要成分洗脱完全，适合用于药材色谱指纹图谱的建立。

2.1.3 蒸发光散射检测器

蒸发光散射检测器（evaporative light-scattering detector，ELSD）是通用型检测器，可检测非挥发性有机物，如皂苷［14］、糖苷［15］等成分。其检测步骤包括雾化、蒸发和激光检测［16］。实验中发现蒸发管温度的设定对分析影响较大，当蒸发管温度设定为高于80℃时，会导致相关色谱峰的消失（见图3）。而温度设定为40℃此峰保留，且其他因素对试验的影响不大。

图2 不同色谱柱分离所得的色谱图Fig.2 Chromatograms from different columns

图3 不同检测温度下的色谱图Fig.3 Chromatograms at different temperatures of evaporation

2.2 方法学考察

2.2.1 精密度试验

取同一批次的龙葵药材粉末1份，按1.4.1节方法制备供试品溶液，连续进样5次。将测得的色谱图导入“中药色谱指纹图谱相似度评价系统（2012.1版本）”进行比较。5次试验之间的相似度均大于0.95，相对峰面积RSD均小于3.0%，表明精密度良好。

2.2.2 重复性试验

取同一批次的龙葵样品粉末5份，以1.4.1节方法制备供试品溶液，分别进样测定。将测得的色谱图导入“中药色谱指纹图谱相似度评价系统（2012.1版本）”进行比较。5次试验之间的相似度均大于0.95，相对峰面积RSD均小于3.0%，由以上试验可知重复性良好。

2.2.3 稳定性试验

取同一批次的龙葵药材粉末，制备供试品溶液，分别在制备后 0 h、1 h、2 h、4 h、8 h、24 h、2 d、15 d时间段进样，进行测定。将测得的色谱图导入“中药色谱指纹图谱相似度评价系统（2012.1版本）”进行比较，8次实验相似度大于0.95，相对峰面积RSD均小于3.0%，由以上试验结果可知，样品在15 d内保持稳定。

2.3 指纹图谱研究

取41批来自各个产地的药材，分别按1.4.1节方法制备供试品溶液，按1.3节的色谱条件分别进样，记录各批药材的色谱图。通过提取各色谱图，导入至“中药色谱指纹图谱相似度评价系统（2012.1版本）”，进行相似度计算（见表2），并建立指纹图谱进行比较。

经过相似度软件处理可以看出不同产地的龙葵药材之间化学成分存在较大的差异，根据它们的相似度值，将收集到的34批龙葵药材可分为3类：第一类：药材色谱图的相似度小于0.5，包括：S24、S28、S30和S31，药材产地分别为上海、广东深圳、广西桂林以及黑龙江鹤岗。这类药材的各成分含量明显有别于其他产地的药材（见图4a），故不适于应用于建立该药材的指纹图谱，应予剔除。第二类：此类药材的相似度在0.5～0.9之间，包括：S9、S13、S17、S18、S19、S20、S22、S23 和 S29，来自河北唐山、安徽黄山、山东德州、湖南郴州、辽宁大连、新疆乌鲁木齐、海南海口、内蒙古赤峰和浙江杭州，由于相似度略低，也不宜采用（见图4b）。第三类：为大部分地区产龙葵药材，这部分药材的色谱图基本相似，相似度在0.9～1.0之间。此类药材的产地为辽宁海城、山东泰安、吉林长春、北京顺义、河北石家庄、吉林农安、河南平顶山、内蒙古通辽、河北唐山、河北廊坊、辽宁朝阳、天津蓟县、吉林四平、辽宁锦州、河南信阳、山东德州、沈阳东陵、沈阳北陵、内蒙古赤峰、陕西西安、河南郑州、山西运城、陕西咸阳等地。从平均色谱图中可以看出，第一类和第二类的龙葵药材样品中相关成分的含量过少，尤其是第一类，可能是产地或气候等因素造成它们与另两类药材的差别特别大。因此，在实际生产使用中，第一类和第二类药材不太适用，所以根据实际应用的需要，优选了第三类的药材，以这类稳定性、均一性都比较好的药材建立指纹图谱。第三类药材的相似度比较接近，说明相关产地的龙葵药材质量有较好的相似性，并且其产地包括了龙葵药材的主要产区，因此，由这些药材得到的平均指纹图谱可以用来反映我国大部分地区龙葵药材的特点，作为这些地区龙葵药材的指纹图谱标准（见图4c）。

表2 34批药材的色谱图相似度Table 2 Similarities of the chromatograms of 34 samples

第三类龙葵的平均指纹图谱包含较多信息且地域涉及较广，可以代表药材的基本色谱特征，为药材之间的比较提供参考依据，因此在建立参照指纹图谱时应将偏差较大的药材剔除。本研究将第一、二类药材共计13批药材剔除，其余的21批产地覆盖较广且相似度都在0.9以上。由表2可知第三类药材指纹图谱的相似度高，接近共有模式，药材来源确切，故将此类药材的平均指纹图谱作为龙葵药材的参照指纹图谱（见图5A），并从中确定了13个共有峰（因1，2，3号峰未完全分离，故不作为共有峰）。

2.4 色谱峰指认

取20 μL配制好的混合对照品溶液注入高效液相色谱仪，按1.3节色谱条件进行分析检测以获取色谱图（见图5B）。将指纹图谱中的共有峰与各对照品的保留时间相比对，确认各峰归属。可确定4、6、7、8、9、10、11、13、14、15 和 16 号峰，分别为 tribu-luside A、5-pregn-16-en-3β-ol-20-one lycotetraoside、亚油酸、软脂酸、油酸、澳洲茄碱、澳洲边茄碱、β2-澳洲边茄碱、nigrumnin I、去半乳糖替告皂甙以及 macrostemososide A，而 1、2、3、5 及 12 号峰尚未能指认。

图4 3类龙葵药材拟合所得平均色谱图Fig.4 Average chromatograms obtained by fitting the chromatograms of three kinds of Solanum nigrum L.samples

图5 龙葵指纹图谱色谱峰的指认Fig.5 Peak recognition of the fingerprints of Solanum nigrum L.

3 结论

本文利用高效液相色谱-蒸发光散射检测开展了龙葵药材的指纹图谱研究，考察了34批不同来源的龙葵药材，选取其中21批相似度大于0.9、具备广泛代表性的药材，建立了包含13个共有峰的参照指纹图谱，并对其中的11个色谱峰进行指认。研究结果表明，利用高效液相色谱法结合蒸发光散射检测得到指纹图谱，可以鉴定与评价中药材中的非挥发性成分。该方法可以进一步拓展，应用于其他中药材中的内源产物指纹图谱库的建立，为中药的真实性、优良性和稳定性评价提供新的技术方法和实验依据，还可与传统的基于紫外检测器的技术进行相互验证和补充，为中药提供更加准确有效的分类鉴定标准。

［1］ Pharmacopoeia Commission of People’s Republic of China.Pharmacopoeia of People’s Republic of China，Part 1.Beijing：China Medical Science Press（国家药典委员会.中华人民共和国药典，一部.北京：中国医药科技出版社），2000：Appendix 23

［2］ Li Z H，Meng J H，Xiao H.Traditional Chinese Drug Research＆Clinical Pharmacology（李志辉，孟军华，肖晖.中药新药与临床药理），2012，23（6）：661

［3］ Liu L F，Gao B Y，Gao S H.World Journal of Integrated Traditional and Western Medicine（刘林凤，高宝益，高淑红.世界中西医结合杂志），2013，8（2）：144

［4］ Yuan H J，Chen Y G，Cai B C，et al.China Journal of Chinese Materia Medica（袁海建，陈宜刚，蔡宝昌，等.中国中药杂志），2011，36（12）：1630

［5］ Shan H J，Wang B.Chinese Journal of Experimental Traditional Medical Formulae（单会娇，王冰.中国实验方剂学杂志），2010，16（9）：100

［6］ Luo W J，Wang G H，Zhou X L，et al.Modern Oncology （罗文娟，王光辉，周新兰，等.现代肿瘤医学），2007，15（3）：307

［7］ Loganayaki N，Siddhuraju P，Manian S.Food Sci Biotechnol，2010，19（1）：121

［8］ Wang H C，Chung P J，Wu C H，et al.J Sci Food Agric，2011，91（1）：178

［9］ Shan H J，Zhang J K，Xu L，et al.Chinese Traditional Patent Medicine（单会娇，张建逵，许亮，等.中成药），2011，33（3）：483

［10］ WHO.Guidelines for the Assessment of Herbal Medicines.Geneva，1996：178

［11］ Center for Drug Evaluation and Research（CDER）of Food and Drug Administration （FDA）.Guidance for Industry-Botanical Drug Products （Draft Guidance）.Rockville，2004

［12］ Sun G X，Dou X W，Yang L P，et al.Chinese Journal of Chromatography（孙国祥，豆小文，杨兰萍，等.色谱），2013，31（5）：456

［13］ Zhou X L.［PhD Dissertation］.Shenyang：Shenyang Pharmaceutical University（周新兰.［博士学位论文］.沈阳：沈阳药科大学），2006

［14］ Luo D，Luo G A，Chen L，et al.Pharmacy and Clinics of Chinese Materia Medica（罗丹，罗国安，陈丽，等.中药与临床），2014，5（6）：21

［15］ Ding H L，Li C，Jin P，et al.Chinese Journal of Chromatography（丁洪流，李灿，金萍，等.色谱），2013，31（8）：804

［16］ Zhao H，Wang Y H，Liu F，et al.Chinese Journal of Chromatography（赵卉，王玉红，刘芳，等.色谱），2013，31（8）：795