PCR检测上海地区猪痢疾短螺旋体、大肠毛状短螺旋体和胞内劳森菌

张维谊 袁万军 王 建 徐 锋 沈丽萍

(上海市动物疫病预防控制中心,上海 201103)

PCR检测上海地区猪痢疾短螺旋体、大肠毛状短螺旋体和胞内劳森菌

张维谊 袁万军 王 建 徐 锋 沈丽萍

(上海市动物疫病预防控制中心,上海 201103)

2014年10月至2015年10月,从上海市动物疫病预防控制中心门诊、上海地区规模化猪场、屠宰场等采集的回肠、粪便及肛门拭子共254份样本,结合临床表现、病理剖检进行初步鉴定,并通过建立的猪痢疾短螺旋体、大肠毛状短螺旋体和胞内劳森菌多重PCR方法进行鉴定。检测结果显示:猪痢疾短螺旋体阳性7份,大肠毛状短螺旋体阳性为0,胞内劳森菌阳性33份;阳性率分别为2.75%,0,13.0%。结果表明目前上海地区猪痢疾短螺旋体和胞内劳森菌均存在不同程度的感染和流行,这两种病原均可造成严重的经济损失,应当引起足够重视,检测结果可在制定本地区猪腹泻病的防控策略中作为参考。通过胞内劳森菌套式PCR方法检测,结果发现共有36份阳性,阳性率为14.2%。

猪痢疾短螺旋体;大肠毛状短螺旋体;胞内劳森菌; PCR;检测

猪肠道疾病综合征一直是困扰养猪业发展的重大难题，为做到有的放矢的预防和治疗，进行正确的诊断是关键前提。根据相关文献报道，在引起肠道疾病的传染性病原中猪肠道螺旋体和胞内劳森菌是关键性病原，给全球养猪业造成重大经济损失。胞内劳森菌是回肠炎（PE）的病原，猪痢疾短螺旋体可导致猪痢疾（SD），大肠毛状短螺旋体是引起结肠螺旋体病的病原[1-2]。

胞内劳森菌不能用常规培养基培养，两种螺旋体培养条件也比较苛刻，都很难培养并正确鉴别。然而控制这三种不同疾病的传播首要的是做出正确的诊断，继而采取相应的防控措施。之前，在瑞典野猪群中曾检测到过这三种病原[3]。多重PCR方法的应用为快速诊断三种关键性肠道疾病起到了重要作用

了解B.hyo、B.pilo、LI在上海地区的流行状况及其特点对猪肠道疾病的有效预防和控制将具有重要价值，同时对上海地区养猪业的健康发展也有一定促进作用。本试验从临床门诊、规模化猪场、屠宰场等地采集肠道、粪便及肛拭子样本分别进行多重PCR检测和套式PCR检测，以获得上海地区B.hyo、B.pilo、LI流行状况的数据，并为制定合理的防控措施提供依据。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 标准菌株及检测样本

胞内劳森菌B3903株（购自Boehringer Ingelheim），猪痢疾短螺旋体（B78）、大肠毛状短螺旋体（P43/6/78）由德国吉森大学Werner Herbst 博士惠赠。

自2014年10月至2015年10月共从上海市动物疫病预防控制中心门诊（散养户猪场）腹泻病例中检测样本59份，屠宰场样品125份，上海地区规模化猪场样本70份，共计254份。其中肠组织样本220份，粪便样本24份，肛拭子10份。

1.1.2 主要试剂

血液、组织DNA提取试剂盒和粪便DNA提取试剂盒（均购自QIAGEN公司），PCR premix 2×（Takara），DNA Marker（TIANGEN），TAE缓冲液（上海双螺旋），溴化乙锭（Ethidium bromide，EB），DEPC水，无水乙醇等。

1.1.3 主要仪器设备

高速冷冻离心机（Eppendorf），微量移液器，超净工作台（LABCONCO），普通PCR仪（Bio Rad），电子天平（METTLER），恒温水浴锅，凝胶成像系统（CHEMI GENIUS），核酸电泳仪（购自天能生物公司）等。

1.1.4 引物

参考Genebank序列，分别设计针对LI、B.hyo、B.pilo的多重引物[4]（见表1），送上海invitrogen公司合成。所合成的引物均先用DEPC水稀释成浓度20pmol/μl后在用于PCR反应。

1.2 方法

1.2.1 样本核酸的提取

肠道粘膜组织DNA的提取和粪便及肛门拭子DNA的提取分别按QIAGEN血液、组织DNA提取试剂盒和QIAGEN粪便DNA提取试剂盒说明书进行操作。

1.2.2 胞内劳森菌、猪痢疾短螺旋体和大肠毛状短螺旋体多重PCR方法

25μl反应体系：PCR premix 2× 12.5μl，L1/L2、H1/H2、P1/P2 各1μl，DEPC水 3.5μl，DNA模板 3μl。反应程序为：95℃ 10min；95℃ 30s，58℃ 90s，68℃ 2min，35个循环；68℃10min。PCR产物以1%凝胶电泳，并用凝胶成像分析系统观察结果。

1.2.3 多重PCR方法应用

对采集的254份样本核酸进行多重PCR检测，并将检测结果分类汇总。

表1 多重PCR及套式PCR引物

2 结果

2 结果

2.1 PCR电泳结果

电泳后结果如图1。

图1 多重PCR扩增电泳图

2.2 检测结果

根据多重PCR方法对采集的样本进行检测，共计检出胞内劳森菌阳性样本36份，猪痢疾短螺旋体阳性样本7份，大肠毛状短螺旋体阳性样本0份（表2），阳性率分别为14.2%，2.75%，0。在所有样本中仅一份样本中同时检测到胞内劳森菌和猪痢疾短螺旋体阳性，存在混合感染情况，其他均为单一感染。在检测的三种病原中胞内劳森菌检出率最高，为14.2%；猪痢疾短螺旋体次之，为2.75%；大肠毛状短螺旋体检出率为0。对猪痢疾短螺旋体的检测中，健康猪群中检出率差别不大，均在5%左右，在屠宰场样品中未检测到；大肠毛状短螺旋体在健康猪群和发病猪群中均未检测到。

不同日龄的猪阳性率也不一样，3～5周、6～8周、9～12周，大于13周的阳性率分别为15.4%、21.1%、34.1%、4.61%、14.2%，阳性率从最低的是13周龄后的猪，阳性率为4.61%，阳性率最高的是9-12周的猪，阳性率为34.1%，具体数据见表3。

表2 多重PCR检测结果汇总

表3 不同日龄猪检测结果

3 讨论

（1）2014年冬至2015年春全国各地猪群中发生了较严重的传染性腹泻疾病，应用各种抗生素防治无效，其发病率与死亡率很高，造成了重大的经济损失。其病因比较复杂，目前国内外对猪腹泻病的研究比较集中3～5周龄以下猪群的病毒性及细菌性疾病，如传染性胃肠炎、病毒性腹泻、轮状病毒、大肠杆菌、沙门氏菌等。猪痢疾短螺旋体、大肠毛状短螺旋体和胞内劳森菌是引起3～5周龄以上（8～20周龄）猪群腹泻病的关键的细菌性病原，国内对于这三种关键性病原在猪群中的感染情况及流行趋势鲜有报道。针对上述情况，我们从2014年10月至2015年10月对上海地区猪群中的这三种病原的流行情况进行调查，以期获得上海地区猪痢疾短螺旋体、大肠毛状短螺旋体和胞内劳森菌感染情况的相关数据，为指导临床防控提供参考信息。

（2）三种病原分离培养都有一定难度，猪痢疾短螺旋体和大肠毛状短螺旋体为严格厌氧；胞内劳森菌微需氧，严格胞内寄生，只能在特定细胞上培养。利用分离培养方法对这三种病原进行鉴定周期长，效率低，成功率也低。目前比较常用的检测方法是PCR和ELISA，有研究表明，PCR方法最为敏感。

（3）本实验所采用的多重PCR方法能同时检测猪痢疾短螺旋体、大肠毛状短螺旋体和胞内劳森菌三种病原，可应用于猪肠道疾病的快速诊断。该方法做到了普通PCR需要做3次才能完成的检测项目，不仅节省了大量的检测时间和费用，而且具有一定的特异性和敏感性，适应于临床腹泻病流行病学的调查研究。

（4）多重PCR检测结果显示，在采集的254份粪便、回肠和肛门拭子中共检测到7份猪痢疾短螺旋体阳性（阳性率为2.75%），33份胞内劳森菌阳性（阳性率为13.0%），大肠毛状短螺旋体阳性数为0。猪痢疾短螺旋体在门诊和规模化猪场的猪群中检出率均在5～6%之间，在屠宰场样本中检出率为0，表明上海地区发病猪群中存在较低程度的感染，在健康猪群中基本没有。检测到的数据显示大肠毛状短螺旋体阳性率为0，但这并不代表上海地区不存在该菌感染，也应加强防范，预防为主。胞内劳森菌在散养户猪场病例中检出率最高，为28.8%，规模化猪场中检出率也有14.3%。表明上海地区猪群中普遍存在胞内劳森菌感染，但规模化猪场带菌率明显低于散养户猪场，这说明规范化的管理对于防治该病有一定积极意义。从屠宰场采集的外表健康的猪回肠中也检测到6例带菌猪，阳性率4.8%，表明部分屠宰猪感染胞内劳森菌后呈现隐性感染，这可能与抗生素的使用有关。由于当前国内抗生素使用非常普遍，在抗生素作用下未表现出明显的腹泻症状，也因此容易被人们所忽略。

（5）有报道显示，猪群中胞内劳森菌血清学转化常发生在8～10周龄[5]，这与母源抗体的保护性有关，在此阶段失去母源抗体保护后可能增加其感染胞内劳森菌的风险。本研究与国外报道的胞内劳森菌感染年龄阶段基本吻合，结果显示9～12周龄猪感染率最高（34.1%），6～8周龄次之（21.1%），育成猪最低。

[1] 翁善钢.猪痢疾短螺旋体病的诊断与防控[J].养猪，2015，（3）：92-95.

[2] 寇亚辉.猪痢疾短螺旋体的分离、鉴定与血清抗体ELISA检测方法的建立[D]. 南京农业大学，2012.

张维谊（1979—），女，硕士，高级兽医师，一直从事动物疫病的检测，监测、诊断、流行病学调查和相关科学的研究、技术推广。