不良生活习惯对精子DNADNA碎片的影响

徐杰伟 黄永汉 刘雄春 陈美玲中山大学附属佛山医院, 佛山市第一人民医院生殖医学中心（广东佛山 528000）

不良生活习惯对精子DNADNA碎片的影响

徐杰伟 黄永汉 刘雄春 陈美玲
中山大学附属佛山医院, 佛山市第一人民医院生殖医学中心（广东佛山 528000）

摘要目的分析吸烟、喝酒、桑拿生活习惯对精子DNA碎片化的影响，寻找不育症患者的不育影响因素。方法在113例门诊患者中，77例男性不育症患者分为3组：A组为有吸烟/喝酒习惯31人，B组为有桑拿习惯21人，C组为其他不育症25人。另外D组为生育能力正常36人。应用精子染色质结构分析（SCSA）检测以上各组的精子DNA碎片化指数（DFI），分别比较各组间的差异。结果精子DNA碎片化指数（DFI）：A组为（29.03±11.41）%、B组为（28.12±9.56）%、C组为（24.08±6.27）%、D组为（14.87±3.54）%。A、B组分别高于C组，A、B组间比较差异无统计意义（P＞0.05），A、B组分别与C组比较有差异（P＜0.05）；A、B、C组分别与D组比较差异有显著性意义（P＜0.01）。结论男性不育症患者精子DNA碎片化指数（DFI）与正常生育人群有显著性差异，不良生活习惯会加重精子DNA碎片化指数（DFI），可能是引起男性不育的因素。

关键词吸烟; 饮酒; 蒸气浴; DNA碎片裂

近年来， 随着我国男性不育患者人数的增多，有害环境对生育的不良影响越来越受到关注。吸烟、喝酒、桑拿等生活习惯对男性生育能力的影响也越来越受到关注，有研究证实，不良的生活习惯可能影响生殖细胞的成熟和增殖， 甚至直接损害精子，导致精子 DNA 损伤[1-3]，本文将有吸烟、喝酒、桑拿等生活习惯的男性不育患者与生育健康的男性进行比较，现将结果报告如下。

资料与方法

一、研究资料

男性不育诊断标准：夫妻双方未采取避孕措施并且有规律性生活 1 年以上而未受孕， 排除女方因素即可诊断为男性不育。

（一）研究对象

研究对象为2012年8月至2013年6月在佛山市第一人民医院生殖中心男科门诊就诊的男性不育患者77例，分为3组：A组31例，平时有吸烟喝酒的生活习惯（不喜欢桑拿），每天1包烟/每周至少喝酒3次，已有2年以上吸烟喝酒史的患者31例，年龄20～42岁，平均年龄31岁；B组21例，平时有桑拿的生活习惯（不喜欢吸烟喝酒），每周至少2次，并有1年以上桑拿史，年龄20～44岁，平均年龄32岁；C组25例，排除有吸烟、喝酒、桑拿生活习惯的其他不育症患者，年龄22～42岁，平均年龄32岁。另外D组36例，有正常生育能力，且没有不良生活习惯（女方有不孕原因）的患者，年龄20～40岁，平均年龄30岁。

（二）精液标本采集

排除近半年内有持续高热者或精液白细胞 ＞.0×106/mL患者；禁欲2～7d，手淫法采集全部精液于干燥专用采集杯中，置37℃电热恒温水浴箱内液化。

二、仪器与试剂

（一）仪器

美国BD公司FACS Calibur流式细胞仪；美国

AMILTON THORNE BIO-SCIENCES 公司 Version 4 IVOS 精液分析仪。

（二）流式细胞仪试剂

按照孙静波等[4]方法改进配置自配试剂：（1）0×TEN 缓冲液；（2）酸处理液；（3）1 g/L吖啶橙（AO）储存液；（4）染色缓冲液；（5）AO染液；（6）AO平衡缓冲液。存放在4℃冰箱备用，使用时所有试剂和缓冲液保持在4℃冰水中进行。

三、方法

（一）精液分析

精液液化后以 WHO《人类精液检查与处理实验室检验手册》（第5版）推荐的正常参考值为参照标准，用美国HAMILTON THORNE BIO-SCIENCES公司 Version 14 IVOS 精液分析仪对精液进行常规参数检测，记录精液体积、精子浓度、精子前向运动率（PR）、精子非前向运动率（NP）及精子不动率（IM）。

（二）精子染色质结构分析（sperm chromatin structure a ssay，SCSA）

1. 根据 CASA 结果中的精子浓度，用4℃TEN 缓冲液稀释成5×106/mL的精子悬液于精子冻存管，放入4℃冰箱中，在6h内测定。

2. 按照 Evenson 等[5]方法稍加改进，调整流式细胞仪激发光波长488nm和二色滤光片，在峰顶或峰高收集红色荧光（≥630 nm），用AO平衡缓冲液平衡流式细胞仪样品通道。

3. 取50μL稀释精子悬液于进样管中，加入100μL酸处理液（pH1.2），旋涡轻轻混合30s，加300μL AO染液染色后低速流动样品2 min，检查精子流速，如果太快（＞300个/s）重新稀释。每个样品获取和存储1 000个精子的红色荧光，用专门的软件处理得出的精子DNA碎片化指数（DFI）。

四、统计学处理

采用SPSS 16.0统计软件，统计数据结果用x±s表示，用t检验进行两组间比较，以P＜0.05为差异有统计学意义。

结 果

一、4组精子DFIDFI的比较

A 组DFI为（29.03±11.41）%，高于B组[（28.12±9.56）%]和C组[（24.08±6.27）%]，D组为（14.87±3.54）%。A、B组分别与C组比较差异有统计学意义（P＜0.05）， A组与B组比较差异无统计学意义（P＞0.05）。A、B、C组分别与D组比较有显著性差异（P＜0.01），见表1，图1。

二、精液分析常规参数

精液体积、精子浓度及精子非前向运动率（NP%）的结果，A、B、C、D组间比较没有差别（P＞0.05）；精子的前向运动率（PR%）及不动率（IM%）结果，A、B、C组间比较没有差异（P＞0.05），A、B、C组分别与D组比较有显著性差异（P＜0.05），见表2。

表1 4组精子DFIDFI比较

图1 4组DFIDFI的散点图

表2 4组精液常规参数比较

讨 论

随着医学发展，临床和实验室的相关诊断或检测也不断进步，能够对男性不育患者病因进行确诊，但仍有30%左右的男性不育患者并不能找到不育原因。在男性不育患者中精子DNA损伤是很重要的临床研究领域，精子DNA受损可能是精子发生过程中DNA转化出现异常，也可能与精子自身的凋亡有关。Larson等[6]研究认为，精子DNA受损在不明原因不育男性患者中的比率较高，可能为男性不明原因不育的一种解释。精子DNA 的完整性是遗传物质正确传递给子代的前提，在受精和胚胎发育中发挥重要作用[7]。许多研究[8-10]表明精子DNA 损伤会造成男性不育。

从本研究精子DNA碎片化指数（DFI）实验数据可知，有不良生活习惯不育症组（A、B组）比没有不良生活习惯不育症组（C组）的DFI均值高，不育症组（A、B、C组）比有正常生育能力组（D组）的DFI均值高，本实验在研究对象选择时就排除了发烧、感染的影响因素，但实际生活中还存在很多不为人知的不育影响因素有待不断探索，因此在C组的实验数据中去除了偏差特别大的DFI数据。从本实验DFI统计数据结果可知，A、B组分别与C组比较有显著性差异（P＜0.05），说明不良生活习惯会加重精子DNA损伤，产生更多的碎片，人们生活中的不良生活习惯的确对正常生育造成一定的影响。从精液常规分析常规参数结果可知，在不育症组（A、B、C组）中精子前向运动率（PR）及精子不动率（IM）组间比较没有显著性差异（P＞0.05），而DFI指标在A、B组分别与C组比较有显著性差异（P＜0.05），说明精液常规参数与DFI不一致，精液常规结果正常的精液标本也有部分存在精子DNA损伤严重，出现较高的DFI值，这与相关文献报道一致[11]，精子DNA碎片化检测有更进一步的意义。在不育症组（A、B、C组）分别与有正常生育能力组（D组）比较中，统计数据结果显示DFI组间比较有显著性差异（P＜0.01），说明不育组精子DFI显著高于有正常生育能力组，这与国内外相关文献报道一致[12-14]。在不育症组与有正常生育能力组比较中精液体积、精子浓度及精子非前向运动率（NP）组间比较没有显著性差异（P＞0.05）、精子前向运动率（PR）及精子不动率（IM）组间比较有显著性差异（P＜0.05）。从上面结果可知，精子DFI指标与PR及IM常规参数有相关，存在数据统计结果一致性，说明精液常规结果异常的精液标本通常情况下，其精子DNA损伤程度比较重，产生精子DNA碎片较多[11]。

在男性不育患者中，精子DNA损伤可能是独立的精子质量评价指标[15]，对男性不育患者行精子DNA损伤检测并寻求改善精子DNA损伤的方法具有重要的临床意义。吸烟作为一项不健康的生活习惯，是影响男性生育能力的一个重要危险因素。香烟中含有尼古丁、一氧化碳、 镉等有害物质，这些有害物质可影响男性睾丸生殖细胞， 具有抑制性激素分泌和杀伤精子的作用[16]。有人研究[17]， 烟草浓聚物及其代谢产物中富含诱基因突变和诱癌物质，造成精子DNA合成受阻，产生突变，导致精子DNA损伤。这与本文研究结果一致。酒的主要成分是水和乙醇，乙醇可通过对人体生殖功能造成不同程度的破坏导致不育[18]，其发生机制可能与下列原因有关：酒精可破坏睾丸间质细胞，抑制了睾丸内维生素A的活性， 导致生精功能降低，出现少精子症或无精子症；酒精使精子 DNA 的高甲基化印迹区域去甲基化,从而使精子DNA合成障碍[19-21]。精子最适宜的温度是20～40℃，过高过低都会影响精子的活动力，造成精子死亡，而导致精子DNA的损伤[22]。

综上所述，吸烟、喝酒或桑拿等不良生活习惯的确损伤精子DNA的完整性。精子DNA碎片化检测作为精液常规检查的补充，在评价男性不育中有重要临床意义，是较好的评估精液质量和男性生育能力的参考指标。

参 考 文 献

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（2014-11-08收稿）

doi:10.3969/j.issn.1008-0848.2015.02.009

中图分类号R 698.2

The effects of unhealthy lifestyle on DNA fragmentation index

Xu Jiewei, Huang Yonghan, Liu Xiongchun, Chen Meiling
Department of the Reproductive Center, Foshan Hospital Affi liated to Sun Yat-san University/the First People's Hospital of Foshan, Foshan 528000, Guangdong, China

AbstractObjective To investigate the effects of cigarette, alcohol and taking sauna on DNA fragmentation index (DFI) in infertile males, and fi nd out impact factors related to infertility. Methodsthods Total of 113 male patients including 77 infertile males and 36 with normal reproductive ability were recruited in the study. All patients were classifi ed into Group A(31 infertile males with a habit of smoking/taking alcohol), Group B( 21 infertile males with a habit of taking sauna), Group C(25 infertile males with other relative pathogenesis) and Group D(36 males with normal reproductive ability as control). Semen samples were collected from each patients and their DFI were detected by a sperm chromatin structure assay (SCSA). Resultssults DNA fragmentation index in Group A, Group B, Group C and GroupD was 29.03±11.41%, 28.12±9.56%, 24.08±6.27%, and 14.87±3.54%, respectively. No signifi cant difference in DFI was found between Group A and B(P>0.05). DFI in Group A and Group B were significantly higher than that in Group C (P<0.05). DFI in Group A、B and C was signifi cantly different from that in Group D, respectively (P<0.01). Conclusionusion DFI is higher in infertile males than that in males with normal reproductive ability. And unhealthy lifestyle may affect DFI of their sperm, and further result in infertility.

Key wordsords smoking; Alcohol Drinking; Sauna; DNA fragmentation