布拉迪酵母菌对菌群失调肉鸭肠道酶的修复作用

王琨 马治敏 常超 王学东 伍金娥

摘要：研究了布拉迪酵母菌（Saccharomyces boulardii）对肠道菌群失调樱桃谷肉鸭肠道酶的修复作用。将25只樱桃谷肉鸭随机分成正常对照组（5只）、抗生素组（20只）。建立樱桃谷肉鸭菌群失调模型，菌群失调模型建立后，抗生素组分为4组，每组5只：即氨苄青霉素组，布拉迪酵母菌低剂量组（试验Ⅰ组）、中剂量组（试验Ⅱ组）、高剂量组（试验Ⅲ组），其中，氨苄青霉素组立即屠宰取样并测定相关指标，各剂量布拉迪酵母菌组按每天200 mL/只饲喂各剂量酵母菌菌悬液，正常对照组自由饮水，各组连续饮用15 d。观察各组肠黏膜酶活性和基因表达的变化。结果表明，布拉迪酵母菌具有调节和增强双糖酶的活性、营养物质的吸收能力，对肉鸭黏膜蛋白质含量无显著影响。

关键词：布拉迪酵母菌（Saccharomyces boulardii）；菌群失调；黏膜酶活；基因表达

中图分类号：S834 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2015）11-2690-04

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2015.11.035

Effect of Saccharomyces boulardii on Intestinal Enzyme Activity of

Meat Ducks with Intestinal Dysbacteriosis

WANG Kun，MA Zhi-min，CHANG Chao，WANG Xue-dong，WU Jin-e

（College of Food Science and Engineering， Wuhan Polytechnic University， Wuhan 430023， China）

Abstract：The experiment aimed at studying the repair effect on intestinal dysbacteriosis ducks by Saccharomyces boulardii. 25 Cherry valley ducks were randomly divided to 5 groups such as normal control group， four test groups which need construct intestinal dysbacteriosis model first for 10 days. After the dysbacteriosis model constructed the four groups were treated with ampicillin and different doses of Saccharomyces boulardii 200 mL per duck for 15 d. The ampicillin group were slaughtered after treatment and tested correlative index， and the Saccharomyces boulardii groups were observed about intestinal enzyme activity and gene expression. The results showed that Saccharomyces boulardii could moderate and enhance the activity of disaccharidase and absorption of nutrients， and had no significant effect on the intestinal mucosa protein of meat duck.

Key words： Saccharomyces boulardii；dysbacteriosis； mucosa enzyme activity；gene expression

随着养殖业的发展，长期大量滥用抗生素导致畜禽肠道结构发生了改变，并且影响动物的免疫机能，应用微生态制剂代替兽药改善动物肠道结构一直是畜牧研究学者关注的焦点。

正常情况下，肠道菌群具有特定的定性、定位和定量结构，种群间处于一种有利于机体健康的动态平衡状态。但当这些正常的微生物菌群受到宿主生理状况及饮食、药物等的影响时，肠道正常菌群在种类、数量和比例上发生异常的变化，偏离正常的生理状态，转变为病理性组合状态，即菌群失调[1]，临床上以腹泻为明显症状[2]。肠道菌群紊乱广泛存在于动物生产实践和临床医学实践中，肠道菌群失调将直接破坏肠道机械屏障，通过维护调整肠道微生态，对于维持肠道黏膜屏障完整结构和正常消化吸收功能无疑具有重要的意义。布拉迪酵母菌在肠道修复中有着重要的作用，布拉迪酵母菌与肠道黏膜相互作用，能防止病原体入侵，调节宿主免疫应答，减少炎症物质分泌，抑制细菌毒素作用并且加强小肠黏膜刷毛缘酶活性增强营养物质的运输[3]。本试验以添加氨苄青霉素造成肉鸭肠道菌群紊乱模型的肉鸭为研究对象，通过在饮水中用不同剂量的布拉迪酵母菌调节菌群紊乱肉鸭，测定肉鸭肠黏膜酶活性和肠黏膜蛋白质、DNA以及RNA含量，为该微生态制剂的推广应用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验样品与日粮

氨苄青霉素购自武汉市华顺生物技术有限责任公司；布拉迪酵母菌由法国百科大制药厂生产，试验用布拉迪酵母菌菌悬液108 CFU/L、109 CFU/L、1010 CFU/L。饲料配方见表1所示。

1.2 仪器与试剂

测定仪器：GHP-9050型隔水式恒温培养箱、YM50型全自动电热立式消毒器、全自动生化分析仪、WFJ7200型可见分光光度计、SPV-2000型紫外可见分光光度计、HH-恒温水浴锅、IKA ULTRRAX-UT TD C（SO）型匀浆器等。

试剂盒：ATP酶测试盒、二糖酶（蔗糖酶、麦芽糖酶）测试盒、蛋白质定量测试试剂盒，购自南京建成科技有限公司。

其他：高氯酸，国药集团化学试剂有限公司。

1.3 试验动物与设计

樱桃谷肉鸭（1日龄），购自武汉市春江禽业有限责任公司。将25只樱桃谷肉鸭随机分为对照组（5只）、抗生素组（20只）。樱桃谷肉鸭菌群失调模型的建立需要10 d，具体参见文献[4]，菌群失调模型建立后，抗生素组分为4组，每组5只：即氨苄青霉素组，低剂量组（试验Ⅰ组）、中剂量组（试验Ⅱ组）、高剂量布拉迪酵母菌组（试验Ⅲ组），其中，氨苄青霉素组立即屠宰取样并测定相关指标，其目的在于比较布拉迪酵母菌组与病理组间的区别以及布拉迪对病理黏膜的修复效果。各剂量布拉迪酵母菌组按每天200 mL/只饲喂各剂量酵母菌菌悬液，对照组自由饮水，各组连续饮用15 d。菌群失调模型成功建立后开始饲喂布拉氏酵母菌记为修复试验的第一天。

1.4 饲养管理

按照常规肉鸭饲养方法，分0～3周龄和4～7周龄两个时期饲养。试验前将鸭舍及附属设备用福尔马林和高锰酸钾溶液消毒，使门窗完好、排水通畅，通风保温性能好。全期笼养，自由采食。

1.5 检测指标及测定方法

1.5.1 肠黏膜酶活性的测定 修复试验第16天屠宰试验鸭，取试验鸭的十二指肠、空肠、回肠，解剖各肠段，刮下肠黏膜，按照各种酶的测定方法的要求进行匀浆，测定酶活性。

1）ATP酶活性的测定：南京建成ATP酶测试盒测定（十二指肠、空肠、回肠肠黏膜等量混合物）。

2）二糖酶（蔗糖酶、麦芽糖酶）活性的测定：南京建成二糖酶测试盒（A082-3）测定（十二指肠、空肠、回肠肠黏膜等量混合物）。

1.5.2 肠上皮细胞基因表达的测定

1）黏膜中蛋白质含量的测定：南京建成蛋白质定量测试试剂盒测定（十二指肠、空肠、回肠肠黏膜等量混合物）。

2）DNA、RNA含量的测定，按文献[5]进行操作，步骤如下：①取2 mL 1%黏膜匀浆上清液，加入1 mL 0.6 moL/L的冷高氯酸中混匀；②冰上静置10 min，充分溶解其样本中蛋白质，500 r/min离心10 min，弃上清液；③再用2 mL 0.2 mol/L的冷高氯酸洗涤2次，挥发余酸；加入2 mL 0.3 mol/L的氢氧化钾，37 ℃下孵育60 min；④加入1 mL 1.2 mol/L的冷高氯酸，冰上静置10 min，500 r/min离心15 min，收集此上清液a；⑤沉淀物再用2 mL 0.2 mol/L的冷高氯酸洗涤1次，再次离心收集上清液b，混合两次上清液，用于RNA浓度的测定； ⑥将分离的RNA溶液于260 nm和232 nm波长下测定各管吸光度。

计算RNA含量采用以下公式：

CRNA（μg/mL）=（3.4×OD260 nm-1.44×OD232 nm）/0.068

上述公式所得的结果再乘以样品的稀释倍数，即得到原样品的RNA浓度，结果以mg/g表示。

在以上步骤所剩余沉淀物中加入4 mL 1 mol/L的冷高氯酸，沸水浴中加热10 min，500 g，离心20 min，除去变性蛋白，取上清液于260 nm、280 nm和320 nm，1 cm光径，用1 mol/L的冷高氯酸调零，测各管吸光度。

计算DNA含量采用以下公式：

CDNA（μg/mL）=（OD260 nm-OD320 nm）×62.9-（OD280 nm-OD320 nm）×36.0

上述公式所得的结果再乘以样品的稀释倍数，即得到原样品的DNA浓度，结果以mg/g表示。

1.6 统计分析

试验数据利用EXCEL进行数据整理，采用SPSS17.0软件中的平衡试验设计方差分析过程进行数据统计分析，均值的多重比较采用Duncans法和LSD法，结果采用平均值±标准差表示。

2 结果与分析

2.1 布拉迪酵母菌对肉鸭肠黏膜ATP酶活性的影响

由表2可知，各组之间ATP酶活性的影响差异不显著（P>0.05）。试验组Na+-K+-ATP酶活性与对照组相比无显著差异（P>0.05），各试验组与氨苄青霉素组相比均有提高。Mg2+-ATP酶活性各组之间差异不显著（P>0.05）。Ca2+-ATP酶活性的研究结果显示，氨苄青霉素诱导的肉鸭腹泻模型中的Ca2+-ATP酶活力相对正常对照组下降，试验Ⅰ组酶活性有所上升；试验Ⅱ组酶活力上升明显，但差异不显著，试验Ⅲ组的Ca2+-ATP酶活与对照组相比提高了13.39%（P>0.05）。Mg2+-Ca2+-ATP酶活力与对照组、氨苄青霉素组相比均无显著差异。

2.2 布拉迪酵母菌对肉鸭肠黏膜双糖酶活性的影响

双糖酶位于小肠黏膜纹状缘上，是重要的糖类消化酶，双糖酶的缺乏或活性降低均可引起双糖分子在肠道内水解减少，出现吸收障碍、腹泻、消化不良等症状。继发感染性腹泻引起小肠黏膜受损后，导致双糖酶活性下降。本研究中选取蔗糖酶和麦芽糖酶为对象，考察给菌群失调的肉鸭自由饮用不同剂量的布拉迪酵母菌对双糖酶活性的影响。

由表4可知，与对照组相比，氨苄青霉素组与饲喂布拉迪酵母菌组的蔗糖酶活性均降低，表明抗生素导致的腹泻可继发双糖酶活性下降。但是饲喂布拉迪酵母菌组之间与氨苄青霉素组相比，并未表现出显著的剂量依赖关系，低、高剂量组的蔗糖酶活性显著上升（P<0.05），中剂量组酶活上升程度缓慢；麦芽糖酶表现出显著的剂量依赖关系，高剂量组酶活最高，可达30.50±2.07 U/（mg·prot）。据研究表明，双糖酶活性与十二指肠黏膜的绒毛萎缩程度有相关性[6]，提示布拉迪酵母菌组具有调节绒毛形态均正常，增加双糖酶活性。人类志愿者和试验小鼠通过口服冷冻干燥制备的布拉迪酵母菌，在肠道内能产生积极的效果，包括增加营养吸收和肠道蠕动、增加蔗糖酶、麦芽糖、糖化酶、乳糖、海藻糖、氨基肽酶、碱性磷酸酶在肠道上皮细胞及腔内液中的含量，提高和加强sIgA分泌合成受体[7]。从本试验结果来看，布拉迪酵母菌具有调节和增强双糖酶的活性。

2.3 布拉迪酵母菌对肉鸭肠黏膜细胞蛋白质含量及基因表达的影响

2.3.1 布拉迪酵母菌对黏膜中蛋白质含量的影响 由于上述几种酶位于小肠细胞内，因此通过对黏膜中总蛋白质含量来间接反映总酶含量与上皮黏膜细胞中的蛋白质含量。布拉迪酵母菌对肉鸭肠道黏膜蛋白质含量的影响见表4。由表4可知，试验Ⅱ组肠道黏膜蛋白质含量最大即4.55 mg/mL，试验Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ组与氨苄青霉素组相比分别提高了3.49%（P>0.05）、32.27%（P<0.05）、11.34%（P>0.05），由此可以得到，酵母菌可以提高肠道黏膜中蛋白质的含量。

2.3.2 布拉迪酵母菌对肉鸭肠黏膜DNA、RNA含量的影响 RNA的含量与蛋白质的合成代谢直接有关，RNA/DNA的增加，表明合成蛋白质能力增强，生长速度越快，试验Ⅱ组RNA/DNA最大，合成蛋白质能力最强。布拉迪酵母菌对肉鸭肠黏膜DNA、RNA含量的影响见图1。由图1可知，试验Ⅱ组提高量最为显著；与对照组相比，试验Ⅱ组提高了肉鸭肠道黏膜的DNA的含量，表明其有促进肠黏膜细胞增殖的作用。

3 讨论

3.1 布拉迪酵母菌对肉鸭肠黏膜酶活性的影响

小肠在食物消化吸收过程中占主导地位，小肠消化主要包括肠腔消化和黏膜消化，肠上皮的微绒毛上存在黏膜消化的酶类，这些酶能促进营养物质的吸收[8]。小肠黏膜中存在十二指肠腺和小肠腺[9]。日粮中的碳水化合物主要由多糖、寡糖、二糖和单糖组成，其中单糖可被直接吸入体内，二糖则不能被小肠直接吸收。小肠黏膜上的二糖酶能将二糖水解成单糖后被机体吸收利用，由此可见，在碳水化合物的吸收利用中，小肠黏膜二糖酶有着极其重要的作用[10]。Buts等[11]研究发现，对小鼠近回肠段切除后，连续8 d灌喂布拉迪酵母菌，横断组切除黏膜增生并显著减少了蔗糖酶、乳糖酶和麦芽糖酶的活性；与横断组相比，布拉迪酵母菌组没有影响黏膜增生但增加双糖酶的活性。ATP酶是组织细胞和细胞器的膜上的一种蛋白酶，在物质运输、能量转换以及信息传递方面有着极其重要的作用。有报道，酿酒酵母菌能够使细胞质中的Na+和K+含量维持在正常的使用范围内，包括血浆膜中的H+-ATP酶、Na+-ATP酶、Na+/H+逆向转运蛋白、K+（Na+）转运蛋白[12]。Na+-K+-ATP酶和Ca2+-ATP酶活性的大小则是反应能量代谢和功能有无损伤的一个重要标志[13]，与电解质和水的吸收有关。小肠黏膜Na+-K+-ATP酶活性的高低反映小肠对营养物质的吸收能力，该酶活力减少时，肠道对氨基酸、葡萄糖、Na+等营养物质的吸收减少，排除增多。小肠对糖和蛋白质的吸收与钠吸收偶联，钠泵分解ATP产生的能量以维持钠和钾的浓度[11]。本试验结果表明，酵母菌组修复菌群失调肉鸭后，对ATP酶活性无显著影响，氨苄青霉素组对营养物质的吸收能力减弱，酵母菌提高了肉鸭对营养物质的吸收能力。由酵母菌对菌群失调肉鸭的调整作用可见，酵母菌使肉鸭肠黏膜上蔗糖酶活性降低。中、高剂量布拉迪酵母菌组与对照组相比提高了麦芽糖酶活性，酵母菌可以提高肉鸭对麦芽糖的吸收能力。

3.2 布拉迪酵母菌对肉鸭肠黏膜细胞蛋白及基因表达的影响

肠黏膜中DNA、RNA以及蛋白质的含量改变可以反映细胞功能和形态的改变。RNA含量的增加，通常是指蛋白质合成的增加，其一是黏膜内蛋白质增加，其二是参与机体黏膜内蛋白质黏膜合成过程中的蛋白酶的增加。黏膜内的DNA和RNA含量的降低表明动物肠黏膜细胞的增殖能力下降，损伤后修复过程减慢[14]。本研究中采用RNA/DNA的比值来评价酵母菌提高肠道黏膜蛋白质含量的趋势，中剂量布拉迪酵母菌促进肠黏膜细胞增殖的作用。

对菌群失调肉鸭连续饲喂布拉迪酵母菌15 d，酵母菌提高了肉鸭对营养物质的吸收能力，并能在一定程度上提高肠黏膜上蔗糖酶、麦芽糖酶活性、各种ATP酶活性，中剂量组显著提高黏膜中蛋白质含量，并能促进肠黏膜细胞增殖。布拉迪酵母菌对肠道菌群失调有一定的修复作用，其具体作用机制还需要进一步探讨。

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