猪OLR1基因多态性与肉质性状的关联分析

郭咪咪 梅书棋 乔木 吴俊静 赵康 程尧 李助南

摘要：为鉴定与猪的肉质性状有重要影响的分子标记，经克隆测序，鉴定出OLR1基因第5内含子存在C52T突变，通过PCR-PstⅠ-RFLP方法进行了基因型检测，分别计算了该SNP在大白猪、长白猪、梅山猪、大白×梅山F2代猪中的基因型频率和基因频率，并且对大白×梅山F2代猪的基因型与肉质相关性状进行了关联分析。结果表明，CC基因型的肩部膘厚、胸腰椎间膘厚、平均背膘极显著高于CT基因型个体（P<0.01）；CC基因型的皮率、瘦肉率、6-7腰椎间膘厚、花油重、臀部膘厚、背最长肌大理石纹、股二头肌大理石纹显著高于CT基因型（P<0.05），C等位基因对猪的脂肪沉积具有正效应。

关键词：猪；OLR1；PCR-PstⅠ-RFLP；肉质性状；关联分析

中图分类号：S828 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2015）11-2686-04

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2015.11.034

Association Analysis on Meat Quality Traits and Polymorphism in Porcine OLR1 Gene

GUO Mi-mi1，MEI Shu-qi2，QIAO-Mu2，WU Jun-jing2，ZHAO Kang2，CHENG Yao1，LI Zhu-nan1

（1. College of Animal Science， Yangtze University， Jingzhou 434025， Hubei， China；

2.Institute of Animal Science and Veterinary Medicine， Hubei Academy of Agricultural Science， Wuhan 430064， China）

Abstract： To identify DNA markers which have significant effect on pig meat quality traits， the single nucleotide polymorphism （SNP） and genotype were tested by sequencing and PCR-PstⅠ-RFLP method，respectively. The results showed that a SNP （C52T） was found in intron 5，then the gene and genotype frequency in the Large White， Landrace， Meishan，Large White×Meishan F2s populations and the association analysis was performed in Large White×Meishan F2s pigs were analyzed. The results showed that the fat thickness， thorax-waist fat thickness and average backfat thickness of CC genotype pigs were extremely significantly higher than that of CT genotype（P<0.01）； CC genotype pigs had significant higher skin percentage， lean meat percentage，6-7 rib fat thickness，dressing percentage， hip fat thickness， meat marbling of longissimus dorsi and meat marbling of biceps femoris than that of CT genotype（P<0.05）. The results also showed that C allele had positive effect on fat deposition of pigs.

Key words： pig； OLR1； PCR-PstⅠ-RFLP； meat quality traits； association analysis

OLR1基因是动脉粥样硬化的候选基因，主要氧化低密度脂蛋白（OxLDL）内皮细胞，调节动脉粥样硬化病变和参与一些细胞过程，影响动脉粥样硬化的发病机制[1]。OLR1基因对血管内皮细胞的损伤、参与动脉粥样硬化的形成和发展过程中发挥了重要作用[2，3]。

目前关于OLR1基因的研究主要集中在对人的心血管疾病和奶牛的产奶性状方面[4-6]。Liu等[7]对3′-UTR C188T和G501C多态性进行研究，结果表明，G501C突变位点的SNP对脑梗塞有显著影响，3′-UTR处的SNP C188T对脑梗塞无显著影响。Khatib等[8]在OLR1基因上发现8个单核苷酸多态性，其中第4外显子上有2个SNP；第4内含子有5个SNP；3′-UTR有1个SNP，3′-UTR的g.8232的SNP多态性可能控制奶牛的乳脂量和乳脂率，该突变位点也影响OLR1 mRNA的翻译及稳定性。Schennink等[9]对OLR1基因g.8232 C/A突变位点与荷斯坦奶牛产奶性状进行关联分析，发现该位点对奶牛乳脂率有显著影响（P<0.05）。李托等[10]对秦川牛OLR1基因g.10497 C/A多态性与肉质性状进行关联分析，研究发现该位点对秦川牛眼肌面积和眼肌深度有显著性影响。猪的OLR1基因位于猪5号染色体上。目前，关于猪的OLR1基因的报道较少，国内外还未对该基因多态性与猪的生产性状进行关联分析。本试验对4种不同品种猪的OLR1基因基因型进行检测，并对大白×梅山F2代猪的胴体性状和肉质性状进行了关联分析，寻找影响猪肉性状的分子标记，为猪的优良育种提供理论依据，以推动猪肉品质改良的育种进程。

1 材料与方法

1.1 材料

大白猪、长白猪、梅山猪、大白×梅山F2代猪均来自湖北省农业科学院优良育种猪场。

1.2 试剂与仪器

主要试剂：组织细胞基因组DNA提取试剂盒购自艾德莱生物公司、2×Taq Master Mix购自Yeastern Biotech公司、DL 2000 DNA Marker 购自TaKaRa生物公司、PstⅠ限制性内切酶购自湖北晶茂生物技术有限公司。

主要仪器：超微量分光光度计Photometer（北京天翔飞域仪器设备有限公司）、DNA Engine PCR仪、DYY-6B电泳仪（北京市六一仪器厂）、LRH-250F生化培养箱（上海一恒科学仪器有限公司）、凝胶成像系统（美国Bio-rad伯乐公司）。

1.3 方法

1.3.1 DNA提取与猪群性状测定 采集试验猪的耳组织约0.5 g，剪碎后按照DNA提取试剂盒（艾德莱生物公司）说明提取基因组DNA，用超微量分光光度计测定其浓度及OD值，将提取后的DNA置于-20 ℃保存。

试验猪群的性状测定包括活体性状测定，体重达100 kg左右时，集中屠宰测定胴体性状、肉质性状和其他性状。测定方法根据《种猪测定原理与方法》进行[11]。

1.3.2 引物设计 根据GenBank数据库中的猪DNA序列（GenBank登录号为CU856657.3），筛查SNP位点，设计引物P1扩增第4、5内含子序列；设计引物P2，进行PCR-RFLP分型，引物均由北京奥科鼎盛生物科技有限公司合成，引物序列及PCR条件见表1。

1.3.3 PCR扩增测序，筛查SNP 用引物P1分别对5头梅山猪和5头大白猪的DNA进行PCR扩增，PCR反应体系如下：2.0 μL DNA混合液模板，上下游引物各1.5 μL （10 μmol/L），25.0 μL 2×Taq Master Mix，加去离子水至50 μL。

PCR反应程序：94 ℃预变性4 min；94 ℃变性40 s，57 ℃退火40 s，72 ℃延伸50 s，共35个循环；72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。将PCR产物送北京奥科生物技术有限责任公司进行双向序列测定，利用Chromas软件对测序结果进行分析。

1.3.4 PCR-PstⅠ-RFLP分析 用引物P2，PCR扩增体系如下：1.0 μL DNA模板，上下游引物各1.0 μL （10 μmol/L），12.5 μL 2×Taq Master Mix，加去离子水至总体积25 μL。PCR反应程序：94 ℃预变性 4 min；94 ℃变性40 s，53 ℃退火40 s，72 ℃延伸 45 s，共35个循环；72 ℃延伸10 min，最后4 ℃保存。

酶切体系：取5.5 μL PCR产物，加入PstⅠ内切酶0.5 μL （10 U/μL），1 μL 10×Buffer（含10×BSA），加去离子水至总体积10 μL，在37 ℃温育过夜，用琼脂糖凝胶电泳检测酶切产物，成像系统观察并记录酶切结果。

1.3.5 统计分析 OLR1基因及基因型频率计算方法参考文献[12]进行，设等位基因C、T的频率分别为p和q，则：

p=（2n1+n2）/2N

q=（2n3+n2）/2N

式中，n1为CC型个体数，n2为CT型个体数，n3为TT型个体数，N为总个体数。

基因型频率=某一基因型个体数/所测个体总数

应用模型对242头大白×梅山F2代猪OLR1基因PCR-PstⅠ-RFLP不同基因型与猪生产性状进行关联分析，所分析的性状主要为胴体性状和肉质性状。

根据Liu[13]所述方法建立单标记回归统计模型，采用SAS统计软件（SAS Institute Inc，Version 8.0）的GLM过程进行单标记方差的统计分析，同时采用REG程序对基因加性效应和显性效应进行计算，并进行显著性检验，所采用模型为：

Yijkl=？滋+Gi+Fj+Sk+Yl+bijklXijkl+eijkl

式中，Yijkl为性状表型值，？滋为平均值，Gi为基因型效应；Sk、Yl、Fj为固定效应，分别为性别、年度、家系效应，bijkl为屠宰体重或屠宰日龄的回归系数，胴体性状以屠宰体重为协变量，肉质性状以屠宰日龄为协变量，eijkl为残差效应。

2 结果与分析

2.1 猪OLR1基因的SNP研究

将获得的5头梅山猪和5头大白猪OLR1基因测序结果，用软件Chromas进行序列分析，分析表明，位点第5内含子的C52T突变，测序图中双峰处即为C/T突变，测序图谱如图1所示。

2.2 猪OLR1基因在不同群体中PCR-PstⅠ-RFLP基因型分析

分析发现，该SNP位点会被PstⅠ（CTGCA^G）限制性内切酶识别，针对该处突变位点设计了表 1所示的引物 P2进行PCR-PstⅠ-RFLP多态基因型分析。PCR产物长度为583 bp，当第5内含子的 C52T位点为C时，不能被PstⅠ酶切，酶切后只有一个片段，长度为583 bp（C等位基因）；当该位点为T时，PstⅠ酶切后产生两个片段，长度分别为172 bp和 411 bp（T等位基因）。猪OLR1基因的PCR-PstⅠ-RFLP酶切分型结果如图2所示。

利用PCR-PstⅠ-RFLP方法，对大白猪、长白猪、梅山猪和大白×梅山F2代猪群体进行基因分型。如表2所示，在长白猪群体中C等位基因的频率等于T等位基因的频率，大白、梅山和大白×梅山猪群体中C等位基因的频率高于T等位基因的频率，尤其是梅山猪群体中C等位基因的频率高达1.00，等位基因C在群体中明显占优势。

2.3 猪OLR1基因的PCR-PstⅠ-RFLP基因型与生产性状的统计分析

对猪OLR1基因PCR-PstⅠ-RFLP不同基因型与猪生产性状进行了关联分析，用于统计分析的试验材料为242头大白×梅山F2代猪，所分析的性状主要为胴体性状和肉质性状。PCR-PstⅠ-RFLP基因型检测结果表明，在所检测的242头试验猪群体中，CC基因型159头，CT基因型83头，TT基因型0头。不同基因型与生产性状间的统计分析结果总结于表3。用SAS统计软件的GLM和REG程序，对242头大白×梅山F2代猪个体基因型与生产性状进行了关联分析，由表3可知，猪OLR1基因多态性与肩部膘厚、胸腰椎间膘厚、平均背膘极显著相关（P<0.01）；与皮率、瘦肉率、6-7腰椎间膘厚、花油重、臀部膘厚、背最长肌大理石纹、股二头肌大理石纹显著相关（P<0.05）。基因效应方面花油重显性效应达到极显著水平（P<0.01）；6-7腰椎间膘厚、臀部膘厚的加性效应和内脂率、背最长肌肌肉色值、股二头肌肌肉色值的显性效应达到显著水平（P<0.05）。

3 讨论

猪的肉质性状属多基因控制的数量性状，由一系列主基因或数量性状位点（Quantitative trait locus，QTLs）决定[14]。分子标记辅助选择在猪的选育方面起着重要的作用，促进了研究者利用相关的分子标记对猪的胴体及肉质性状进行有效的选育，推动了猪肉质改良的育种进程。

对于该位点在不同品种猪群中的多态性分析，在长白猪群体中C等位基因频率与T等位基因频率相等，在大白猪、梅山猪和大白×梅山F2代猪群体中均是C等位基因高于T等位基因，尤其是脂肪型梅山猪群中C等位基因频率高达1.00，该结果表明C等位基因为优势等位基因，且C等位基因对猪的脂肪沉积具有正效应。在对4种不同猪群体的PCR-PstⅠ-RFLP分析中，均未检测到TT基因型的存在，这可能与T等位基因在4种猪群体中含量少或者试验的样本量较少有关。

通过对猪OLR1基因PCR-PstⅠ-RFLP基因型与生产性状关联分析，发现CT基因型比CC基因型具有更高的瘦肉率，差异显著（P<0.05）；胴体性状的肩部膘厚、6-7腰椎间膘厚、胸腰椎间膘厚、花油重、臀部膘厚、平均背膘CC基因型比CT基因型高；肉质性状中的背最长肌大理石纹、股二头肌大理石纹CC基因型比CT基因型高，以上结果表明OLR1基因在猪的脂肪沉积方面具有积极的调控作用，其中CC基因型的个体具有更强的脂肪沉积能力。本研究发现该SNP位点是与猪脂肪沉积相关的分子标记，为标记辅助选择奠定了基础，由于猪脂肪生长发育是一个复杂的生理生化过程，受多种基因调控[15]，其具体的作用机理及遗传机制有待进一步的研究。

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