万寿菊内生真菌WZ2菌株形态鉴定及生物学特性

鲁海菊++施玉梅++潘柳君++王波++郑肖兰

摘要：万寿菊（Tagetes erecta）植株含有噻吩类、萜类、醇类、酮类等具抗植物病虫活性的化合物。从抗病植物中分离内生真菌，进而获得抗病虫活性化合物已成为生物防治的研究热点之一。试验对分离自万寿菊种子中的1株内生真菌WZ2菌株进行形态鉴定，并测定其生物学特性。经显微形态观察发现分生孢子盘褐色，椭圆形或近圆形，（94.9～299.8） μm×（75.4～217.9） μm；刚毛淡褐色，直立，有隔膜，（158.8～174.9） μm×（8.4～9.7） μm；分生孢子淡褐色，椭圆形或近圆形，（8.8～14.8） μm×（7.4～8.8） μm。将其初步鉴定为炭疽菌属的一种（Colletotrichum sp.）。生物学特性测定结果表明最适合其菌丝生长的培养条件为查氏培养基和胡萝卜琼脂培养基；麦芽糖为碳源、酵母膏为氮源、25～30 ℃、pH 10、全光照，其中，适合产孢的培养基为查氏培养基的氮源硝酸钠替换为酵母膏。

关键词：万寿菊（Tagetes erecta）种子；内生真菌；鉴定；生物学特性

中图分类号：Q949.32；Q93-331；Q935 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2015）11-2606-04

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2015.11.012

Identification on WZ2 Strain of Endophytic Fungus from Tagetes erecta and Its Biological Characteristics

LU Hai-ju1，SHI Yu-mei1，PAN Liu-jun1，WANG Bo1，ZHEN Xiao-lan2

（1. Department of Life Science and Technology， Honghe College， Mengzi 661199， Yunnan，China；

2. Environment and Plant Protection Institute，Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences，Danzhou 571737，Hainan，China）

Abstract： The strain Tagetes erecta is a compound of thiophenes，terpene，alcohol and ketone，which had insect resistance activity. Strain WZ2 of endophytic fungus from marigold seed was identified by morphology and the biological characteristics were tested. The results showed that acervulus brown，ellipsoid or sub-globe，94.9 μm～299.8 μm×75.4 μm～217.9 μm. seta pale brown，erect，septate，158.8 μm～174.9 μm×8.4 μm～9.7 μm. Conidia pale brown，ellipsoid or sub-globe， 8.8 μm～14.8 μm×7.4 μm～8.8 μm. It was identified as Colletotrichum sp. by morphology. The best condition that suits the hyphae growth is the Czapek's medium and carrot dextrose agar medium， maltose as carbon source， yeast extract or ammonium sulfate as nitrogen source， 25-30 ℃， pH 10， full of light. The medium which is suitable for sporulation is nitrate nitrogen of Czapek's medium replaced by yeast extract.

Key words： marigold（Tagetes erecta） seed； endophytic fungus； identification； biological characteristics

万寿菊（Tagetes erecta）又名臭芙蓉、万寿灯、蜂窝菊、臭菊花、蝎子菊[1]，是菊科万寿菊属一年生草本花卉[1]。其花中的叶黄素色泽鲜艳、着色力强，安全无毒，广泛用于食品、化妆品等产业，其植株含有噻吩类、萜类、醇类、酮类等抗植物病虫活性的化合物[2]，经济价值很高。植物内生真菌（Endophytic fungi）是一类在健康植物组织内定殖，但不引起病害症状的真菌[3]。它能提高宿主植物对生物胁迫的抗性[4]，还可通过宿主的种子进行遗传[5]。某些内生菌在宿主植物衰老或受到环境胁迫时又会转变为病原菌，使寄主植物发病[6]。

2013年，云南省红河州蒙自市鸣鹫镇万寿菊叶斑病暴发流行，发病率100%。经分离鉴定，此病害由交链孢（Alternaria sp.）引起，疑似种子带菌所致。出人所料的是，反复检测其种子，未分离到交链孢，反而分离到1株生长非常缓慢的内生真菌（WZ2）。目前有关万寿菊内生真菌的研究尚鲜有报道。此菌株是否会产生抗病活性的代谢产物，与其宿主种子之间存在何种生理关系，是否会演变为病原菌，一系列问题有待深入研究。因此，本试验对万寿菊内生真菌WZ2菌株进行形态及其生物学特性研究，为其后续研究提供基础数据。endprint

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 供试菌株 WZ2菌株从蒙自市荣阳工贸有限公司送检的万寿菊种子中分离获得。

1.1.2 供试培养基 PDA（马铃薯200 g、葡萄糖16 g、琼脂粉20 g、去离子水1 000 mL）、PSA（马铃薯200 g、蔗糖16 g、琼脂粉 20 g、去离子水1 000 mL）、MA（玉米30 g、琼脂粉20 g、去离子水1 000 mL）、WA（小麦30 g、琼脂粉20 g、去离子水1 000 mL）、CA（胡萝卜200 g、琼脂粉20 g、去离子水1 000 mL）、Czapeks medium（硝酸钠2.00 g、磷酸二氢钾1.00 g、氯化钾0.50 g、七水硫酸镁0.50 g、硫酸铁0.01 g、蔗糖30.00 g、琼脂粉20 g、去离子水1 000 mL）。

1.1.3 试剂 碳源（葡萄糖、可溶性淀粉、麦芽糖、α-乳糖、鼠李碳、木糖醇、D-甘露醇）、氮源（酵母膏、牛肉膏、蛋白胨、尿素、硫酸铵、硝酸铵、磷酸二氢铵）。上述材料均购自农贸市场及试剂公司，试剂均为分析纯。

1.2 方法

1.2.1 万寿菊内生真菌WZ2菌株形态鉴定 将试管斜面保存的WZ2菌株接种于用酵母膏替换硝酸钠的查氏培养基中，25 ℃恒温培养7 d后，采用插片法用光学镜显微观察孢子形态、产孢结构、菌丝颜色及横隔等微观特征鉴定其种属[7]。

1.2.2 测定不同培养基对菌丝生长的影响 将WZ2菌株在PDA平板培养基中，25 ℃恒温扩大培养7 d，在培养基同一半径周围用打孔器取直径为5 mm的菌丝块，同时接种于PDA（马铃薯葡萄糖琼脂）、CM（Czapeks medium，查氏）、MA（玉米琼脂）、WA（燕麦琼脂）、CA（胡萝卜琼脂）培养基平板中央，设3次重复，25 ℃黑暗培养7 d，用十字交叉法测量菌落直径。

1.2.3 测定碳、氮源对菌丝生长的影响 以查氏培养基为基础培养基，分别用相等质量分数的碳（可溶性淀粉、α-乳糖、麦芽糖、葡萄糖、鼠李糖、木糖醇、D-甘露醇）和氮（硫酸铵、硝酸铵、磷酸二氢铵、酵母膏、牛肉膏、蛋白胨、尿素）替换蔗糖和硝酸钠，接种及测量方法同步骤“1.2.2”。

1.2.4 测定温度对菌丝生长的影响 以PDA为供试培养基，接种后分别在10、15、20、25、30、35和40 ℃下恒温培养，接种及测量方法同步骤“1.2.2。

1.2.5 测定pH对菌丝生长的影响 以PDA为供试培养基，分别用0.1%盐酸及0.1%氢氧化钠将pH调至3、4、5、6、7、8、9和10，接种及测量方法同步骤“1.2.2”。

1.2.6 测定光照对菌丝生长的影响 以PDA为供试培养基，接种后分别在光暗交替（12 h光照，12 h黑暗）、全黑暗和全光照3种光处理下培养，接种及测量方法同步骤“1.2.2”。

1.2.7 数据统计 所有试验数据均采用SPSS 19.0统计软件Duncan多重比较法进行统计分析，计算处理间的差异显著性。

2 结果与分析

2.1 万寿菊内生真菌WZ2菌株形态鉴定结果

孢子盘褐色，椭圆形或近圆形，（94.9～299.8） μm×（75.4～217.9） μm；刚毛淡褐色，直立，有隔膜，（158.8～174.9） μm×（8.4～9.7） μm；分生孢子淡褐色，椭圆形或近圆形，（8.8～14.8） μm×（7.4～8.8） μm。根据形态特征[8-12]（图1），鉴定为炭疽菌属的一种（Colletotrichum sp.）。

2.2 不同培养基对万寿菊内生真菌WZ2菌株菌丝生长的影响

由表1可知，万寿菊内生真菌WZ2菌株在供试的5种培养基上均能生长。其中，查氏及胡萝卜两种培养基与其余培养基相比，其菌丝生长差异极显著，菌落直径最大，说明查氏及胡萝卜两种培养基更适合其菌丝生长。而马铃薯葡萄糖琼脂（PDA）培养基最不适合其菌株菌丝生长。5种培养基中均无孢子产生，说明这5种培养基都不适合WZ2菌株产孢。

2.3 不同碳源对万寿菊内生真菌WZ2菌株菌丝生长的影响

由表2可知，鼠李糖、木糖醇、D-甘露醇3种碳源不能被WZ2菌株吸收利用，可溶性淀粉、α-乳糖、麦芽糖、葡萄糖4种碳源能被吸收利用。其中，麦芽糖与其余碳源差异极显著，菌落直径最大，说明麦芽糖最适合其菌丝生长。上述碳源中均不产孢，说明碳源不是影响产孢的因素。

2.4 不同氮源对万寿菊内生真菌WZ2菌株菌丝生长的影响

由表3可知，万寿菊内生真菌WZ2菌株在供试的7种氮源培养基中均能正常生长，具有较强的氮源适应性。相比较而言，酵母膏中生长的菌丝菌落直径较大，说明酵母膏最适合其菌丝生长，而且适合产孢，其余6种氮源中均不产孢。

2.5 不同温度对万寿菊内生真菌WZ2菌株菌丝生长的影响

由表4可知，万寿菊内生真菌WZ2菌株在10～35 ℃范围内菌丝均能生长，25～30 ℃菌丝生长直径与其余温度差异极显著，菌落直径最大，说明25～30 ℃最适合其菌丝生长，不同的培养温度下均无孢子产生，说明温度不是影响产孢的因素。

2.6 不同pH对万寿菊内生真菌WZ2菌株菌丝生长的影响

由表5可知，万寿菊内生真菌WZ2菌株在不同pH培养基中生长差异极显著，其中，pH 9～10菌落直径最大，说明pH 9～10最适合其菌丝生长。pH 3～7菌丝生长明显受到抑制。不同pH下均无孢子产生，说明pH不是影响产孢的因素。

2.7 光对万寿菊内生真菌WZ2菌株菌丝生长的影响

由表6可知，在光暗交替（12 h光照，12 h黑暗）、全黑暗和全光照3种光处理下，菌丝生长差异极显著，其中，全光照处理菌落直径最大，说明光照有利于其菌丝生长，不同光照条件下均无孢子产生，说明光不是影响产孢的因素。endprint

3 小结与讨论

万寿菊内生真菌WZ2菌株初步鉴定为炭疽菌属的一种（Colletotrichum sp.），其菌丝生长及产孢的培养条件为查氏培养基的氮源硝酸钠替换为酵母膏、25～30 ℃、pH 9～10、全光照。何冬云等[8]在万寿菊种子带菌检测过程中未分离到炭疽菌属。本试验首次从万寿菊种子中分离出炭疽菌属（Colletotrichum）内生真菌。刺五加[9]、印楝[10]、银杏[11]、黄瓜[12]、枣树[13]等宿主中也曾分离出炭疽菌属内生真菌，说明其广泛分布于各种植物中。本试验分离出的WZ2菌株其适合生长及产孢的培养条件为查氏培养基的氮源硝酸钠替换为酵母膏，25～30 ℃、pH 10、全光照。其他培养条件均不产孢。这与大多数炭疽菌菌株有差异。原因还有待进一步研究。近年的研究表明特定的内生真菌可能产生与宿主相类似的生理活性成分[14]，万寿菊提取物具有杀菌[15-18]、杀线虫[19]活性，其活性成分为黄酮[20]、精油[21]，其中，万寿菊根乙酸乙酯提取物对细链格孢（Alternaria aternata）的抑制率达79.77%[16]。WZ2菌株是否能产生与万寿菊相同或相似的生理活性物质，能否抑制万寿菊叶斑病菌（Alternaria sp.）还有待深入研究。另外，炭疽菌属中广泛存在着致病菌，此菌株从经过严格消毒的种胚中分离获得，在其宿主种子的生长发育期中会随着生长传播到根、茎、叶、花中，随着环境条件的改变可能会激发它的致病性，但对这种作用的具体机制还不了解。因此，还有待于进一步研究其与万寿菊生长的关系。

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