twist2在乳腺癌组织中的表达及其临床意义

周淑平 唐朝晖 陈伟军

twist2在乳腺癌组织中的表达及其临床意义

周淑平 唐朝晖 陈伟军

目的 研究twist2蛋白在乳腺组织中的表达及其与临床病理特征的关系。方法 采用免疫组织化学SP法检测20例癌旁正常乳腺组织、6例纤维腺瘤和55例乳腺癌石蜡包埋组织中twist2表达的情况。结果 （1）在乳腺正常组织、纤维腺瘤组织和乳腺癌组织中twist2蛋白表达阳性率分别为0%（0/20）、16.6%（1/6）、72.8%（40/55），差异有统计学意义（P＜0.001）。（2）乳腺浸润性癌中twist2的阳性表达与年龄（P=0.619）、肿瘤组织学类型（P=0.655）无相关性，与临床分期（P=0.017）、淋巴结转移（P=0.030）密切相关。结论 twist2高表达与乳腺癌发生发展、临床分期、淋巴转移密切相关。

乳腺癌；twist2；免疫组化

乳腺癌是女性最常见的恶性肿瘤之一，造成乳腺癌患者死亡的根本原因并不是原发癌的生长，而是肿瘤的转移。肿瘤的发生发展及浸润转移是一个复杂的演进过程。近期研究显示转录因子twist2在肿瘤发生、发展和转移等方面起着重要的作用[1-2]。本研究采用免疫组织化学法检测癌旁正常乳腺组织、纤维腺瘤组织和乳腺癌组织中twist2的表达情况，探讨其在乳腺癌发生、发展及转移中的意义，以期为乳腺癌治疗开辟新途径。

1 资料与方法

1.1 一般资料 永州市中心医院2011年7月～2013年7月女性乳腺手术标本共55例，年龄31～76岁，平均（49.5±0.5）岁。根据2004版世界卫生组织（WHO）乳腺肿瘤组织学分类标准进行分类，其中浸润性导管癌46例，浸润性小叶癌9例，患者术前均未做化疗、免疫及放射治疗。

1.2 主要试剂和方法 兔抗人twist2多克隆抗体购自美国abcam公司，SP试剂盒及DAB显色剂均购自福州迈新生物技术开发有限公司。乳腺癌标本经10%福尔马固定，石蜡包埋，4μm厚连续切片。本研究采用SP法进行免疫组化染色，twist2单克隆抗体浓度为1∶200，具体步骤按说明书进行。用已知有twist2蛋白表达的乳腺癌组织作阳性对照，PBS代替一抗作为阴性对照。

1.3 计算方法 twist2阳性部位定位于细胞胞质和胞核，呈棕黄色颗粒状。胞质染色评分综合肿瘤阳性细胞百分比和染色强度，参照文献[3]。通过计算在总的观察细胞阳性的肿瘤细胞的百分比：0，＜10%；1，10%～20%；2，21%～50%；3，＞50%。染色强度判定是：0，无染色或模糊的染色；1，中2，强阳性染色。这2个分数相加以评估染色：0～1，阴性；2～6，阳性（+）。

1.4 统计学方法 应用SPSS17.0软件进行数据处理。计数资料组间比较采用χ2检验和Fisher’s确切概率法；P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 不同的乳腺组织twist2的表达 乳腺正常组织、乳腺纤维腺瘤组织和乳腺癌组织中twist2蛋白阳性表达率分别为0%（0/20），16.6%（1/6），72.8%(40/55)。乳腺癌组织与正常乳腺组织和纤维腺瘤组织之间差异有统计学意义(P＜0.05），纤维腺瘤组织和正常乳腺组织之间差异无统计学意义。见表1。twist2蛋白在乳腺癌中的阳性表达见图1。

2.2 twist2表达与乳腺癌临床病理特征关系 在55例乳腺癌组织中，乳腺癌Ⅰ/Ⅱ期38例，twist2蛋白阳性表达率为63.2%（24/38），Ⅲ/Ⅳ期17例，twist2蛋白阳性表达率为94.1% （16/17），两者差异有统计学意义(P＜0.05）；有淋巴结转移20例，twist2蛋白阳性表达率为90.0%（18/20），无淋巴结转移的35例，twist2蛋白阳性表达率为62.9%（22/35），两者差异有统计学意义(P＜0.05)。twist2蛋白在乳腺癌中阳性表达与临床分期、淋巴结转移有相关(P＜0.05），而与年龄、肿瘤组织学类型无明显相关。见表2。

表1 twist2在不同乳腺组织中的表达

图1 twist2在乳腺癌组织中阳性的表达

表2 twist2浸润性乳腺癌中表达及临床病理特征的关系

3 讨论

上皮-间质转化(epithelial-mesenchymal transition, EMT)是肿瘤进展中的关键步骤之一，在肿瘤的恶性转化与浸润转移中起重要的作用。twist1和twist2是螺旋-环-螺旋（bHLH）转录因子家族成员，共有超过90%的序列同源性和结构相似的bHLH和C末端域，它们有很多的相似性且在胚胎间充质的发展中发挥重要作用[4]。大量的研究表明，它们可促进细胞生存，细胞的侵袭和迁移，并促进肿瘤血管生成[5]。twist1和twist2是已知的介导EMT在人类癌症转移中的一个关键的调节点[6]。研究表明，twist1在乳腺浸润性小叶癌[7]中可通过

E-cadherin下调促进EMT，但很少有关于twist2在乳腺癌中的表达模式报道。Ponnusamy等[8]与Masuda等[9]发现，twist2在卵巢癌和进展期胃癌中过表达。然而Zhao等[10]研究表明，twist2在肝癌中不表达，且对肝癌的浸润和转移无影响。葛艳等[11]研究表明，twist2在正常宫颈组织、CINⅠ组、CINⅡ～CINⅢ组、宫颈鳞癌组中阳性表达率逐渐递增，尤其在宫颈鳞癌组织中显著增加，且在淋巴结转移组中阳性表达率高于淋巴结未转移组。Li等[14]研究也表明，twist2与宫颈癌进展有密切相关。Fang等[12]研究发现过表达twist2引起EMT及干细胞样肿瘤细胞的自我更新促进乳腺癌细胞的侵袭。本研究结果显示，癌旁乳腺正常组织、乳腺纤维腺瘤组织和乳腺癌组织中twist2阳性表达率分别为0%（0/20）、16.6%（1/6）、72.8%(80/110)。乳腺癌组织与癌旁正常乳腺组织和纤维腺瘤组织之间差异有统计学意义(P＜0.05），在乳腺癌中twist2蛋白的阳性表达率显著高于癌旁正常乳腺组织和纤维腺瘤组织，说明twist2与乳腺癌的发生、发展有密切相关性，这与Ponnusamy等[8]与Masuda等[9]关于twist2在卵巢癌和进展期胃癌中过表达报道一致。在乳腺癌组织中，twist2蛋白阳性表达率在临床TNMⅠ/Ⅱ期和Ⅲ/Ⅳ期分别为63.2%、94.1%，两者差异有统计学意义(P＜0.05)；淋巴结转移组twist2蛋白阳性表达率为90.0%，无淋巴结转移组中twist2蛋白阳性表达率为62.9%，两者差异也有统计学意义(P＜0.05)。twist2蛋白阳性表达率与肿瘤临床分期、淋巴结转移相关，淋巴结转移肿瘤组织twist2蛋白阳性表达率高于无淋巴结转移的肿瘤组织，这与葛艳等[11]关于twist2在宫颈癌中的报道一致。本研究结果表明，在乳腺癌中的twist2表达上调，且twist2表达明显增加，与肿瘤的组织学类型与乳腺癌转移的相关性，因此我们推测twist2可能是一个潜在的诊断乳腺癌的生物标志物。

twist2是能够触发EMT的主要转录因子,故将twist2称之为EMT激活转录因子。研究表明twist2在肿瘤细胞株和移植瘤小鼠模型中表达上调,促进了肿瘤的侵袭，并与临床预后差的人类癌症有关。癌症患者twist1/2高表达则预后差可能与twist1/2抑制凋亡和促进EMT相关[15]。Singh等[16]认为EMT、肿瘤干细胞、药物抵抗一起构成了肿瘤进展的轴线，twist2可能是这个轴线的一个关键环节。发生EMT的特点是E-cadherin蛋白的缺失或功能丧失。虽然E-cadherin在EMT过程中的转录调控作用被公认,但是最近研究指出,只有twist2在内的一小部分转录因子能够直接调节E-cadherin的表达。因此我们可以推测twist2可能是引起乳腺癌的传播的EMT的一个新指标，它是通过何种途径来调节E-cadherin的表达需要我们进一步研究。

[1] Zhang Z,Xie D,Li X,et al.Significance of TWIST expression and its association with E-cadherin in bladder cancer[J].Hum Pathol,2007,38（4）：598-606.

[2] Cheng GZ,Chan J,Wang Q,et al.Twist transcriptionally up-regulates AKT2 in breast cancer cells leading to increased migration,invasion,and resistance to paclitaxel[J].Cancer Res,2007,67(5)：1979-1987.

[3] Yubin Mao,Jinfei Xu,Zhihan Li,et al.The Role of Nuclear β-Catenin Accumulation in the Twist2-Induced Ovarian Cancer EMT[J].PLoS One，2013，8(11)：e78200.

[4] Puisieux A,Valsesia-Wittmann S,Ansieau S.A twist for survival and cancer progression[J].Br J Cancer,2006,94：13-17.

[5] Niu RF,Zhang L,Xi GM,et al.Up-regulation of Twist induces angiogenesis and correlates with metastasis in hepatocellular carcinoma[J].J Exp Clin Cancer Res,2007,26：385-394.

[6] Franco HL,Casasnovas J,Rodriguez-Medina JR,et al.Redundant or separate entities?-roles of Twist1 and Twist2 as molecular switches during gene transcription[J].Nucleic Acids Res,2011,39：1177-1186. [7] Mironchik Y,Winnard PT Jr,Vesuna F,et al.Twist overexpression induces in vivo angiogenesis and correlates with chromosomal instability in breast cancer[J].Cancer Res,2005,65：10801-10809.

[8] Ponnusamy MP,Lakshmanan 1,Jain M,et al.MUC4 mucin-induced epithelial to mesenchymal transition：a novel mechanism for metastasis of human ovarian cancer cells[J].Oncogene,2010,29(42)：5741-5754.

[9] Masuda R,Semba S,Mizuuchi E,et al.Negative regulation of the tight junction protein tricellulin by snail-induced epithelialmesenchymal transition in gastric carcinoma cells[J].Pathobiolo gy,2010,77(2)：106-113.

[10] Zhao XL,Sun T,Che N,et al.Promotion of hepatocellular carcinoma metastasis through matrix metalloproteinase activation by epithelial-mesenchymal transition regulator twistl[J].J Cell Mol Med,2011,15(3)：691-700.

[11] 葛艳，杨永秀，胡乐，等.Twist2和E-cadherin在宫颈鳞癌中的表达及意义[J].国际妇产科学杂志，2014，41(3)：63-72.

[12] Mao Y,Toh HB,Ding Z,et al.Differential methylation of CpG islands within the dermo1 gene promoter in several cancer cell lines[J].Oncol Rep,2011,5：107-111.

[13] Fang X,Cai Y,Liu J,et al.Twist2 contributes to breast cancer progression by promoting an epithlial-mesenchymal transition and cancer stem-like cell self-renewal[J].Oncogene,2011,30：4707-4720.

[14] Li Y,Wang W,Yang R,et al.Correlation of twist2 up-regulation and epithelial-mesenchymal transition during tumorigenesis and progression of cervical carcinoma[J].Gynecol Oncol,2012,124：112-118.

[15] Eckert MA,Lwin TM,Chang AT,et al.Twist1-induced invadopodia formation promotes tumor metastasis[J].Cancer Cell,2011,19：372-386. [16] Singh A,Settleman J.EMT,cancer stem cells and drug resistance：an emerging axis of evil in the war on cancer[J].Oncogene,2010,29：4741-4751.

Objective To investigate the expression and clinincal significance of twist2 gene in human breast tissue. Methods Immunohistochemistry technique was used to detect the twist2 protein among 20 normal samples, 6 fibroadenoma samples ,and110 human breast cancer samples. Results The expression of twist2 was significantly higher than of the other two groups (P＜0.05). High expression of twist2 was significantly related with clinical stage and lymph node metastasis (P＜0.05)，but there was no significantly related with the age and tumor histological type. Conclusion High expression of twist2 was significantly related with the carcinogenesis, clinical stage and lymph node metastasis in breast cancer.

Breast cancer;Twist2;Immunohistochemistry

10.3969/j.issn.1009-4393.2015.10.002

湖南 425000 永州市中心医院病理科 （周淑平 陈伟军） 永州市中心医院肿瘤科（唐朝晖）

唐朝晖 E-mail：112774876@qq.com