牛奶子根多糖的抗氧化性与抑菌作用

吴　美，张　敏（福建省生态产业绿色技术重点实验室，福建省高校绿色化工技术重点实验室，武夷学院 生态与资源工程学院，福建 武夷山354300）



牛奶子根多糖的抗氧化性与抑菌作用

吴美，张敏
（福建省生态产业绿色技术重点实验室，福建省高校绿色化工技术重点实验室，武夷学院 生态与资源工程学院，福建 武夷山354300）

摘要：利用水提醇沉法从牛奶仔根中提取多糖，再经初步纯化后，进行多糖的抗氧化与抑菌作用实验。结果表明，牛奶仔根多糖对DPPH和O2-·有较强的清除作用，最高清除率分别为（84.02±2.84）%和（72.09±5.24）%；对·OH的清除作用效果一般，最高清除率只有（44.2±2.72）%。牛奶仔根多糖对枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌均具有一定的抑制作用，对枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌的抑制作用较为明显。

关键词：牛奶仔根；多糖；抗氧化性；抑菌作用

牛奶子 （Elaeagnus umbellata Thunb.），又名天仙果、半春子、羊奶子等[1]。牛奶子属胡颓子属，落叶灌木，是亚热带和温带地区的常见植物，牛奶子广泛分布于长江流域，华北，华东地区，多生长在向阳的林缘、疏林和灌丛中、荒坡上、沟边及河边砂地[2-4]。具有药用作用，其根入药，具有补中益气等功效，主治风湿痹痛等，还可做烹制菜肴的调味品、保健品及作为观赏品等多种利用价值，是一种价值利用丰富的经济植物[3]。据研究，就牛奶子根而言，就具有补中益气，健脾化湿，行气活血，止泻，用于泄泻，淋病，热咳，跌打损伤，血崩，麻疹[5]。

目前，关于牛奶子的研究，主要集中于其生态学习性，果实性状及营养成分的产地与株间变异研究[6]、组织培养[7]、药用成分分离与测定[8]和牛奶子叶子、枝条、种子中多糖抗氧化活性的研究[9]等等，而对于牛奶子根多糖研究报道很少。

本试验采用Fenton反应法[11]测定牛奶仔根多糖对·OH的清除作用，利用DPPH·乙醇溶液显色[9]测定牛奶仔根多糖对DPPH的清除作用，采用邻苯三酚自氧化法[12]测定牛奶仔根多糖对O2-·的清除作用；通过滤纸片扩散法[13]测定牛奶子根多糖对枯草芽孢杆菌、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌等的抑菌效果研究，旨在为牛奶子植物资源的深入研究提供理论指导。

1　材料与方法

1.1材料与试剂

牛奶子根于2014年购自福建省建瓯市。将购回的牛奶子根先用流水冲净泥土，后用蒸馏水清洗干净，60℃烘干至恒重，粉碎，过40目筛，待用。

细菌：枯草芽孢杆菌、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌由武夷学院生态与资源工程学院微生物实验室提供。

无水乙醇、三氯甲烷、硫酸亚铁、水杨酸、30%双氧水、正丁醇、盐酸、邻苯三酚、三羟甲基氨基甲烷（Tris）、1,1-二苯基苦基苯肼自由基（DPPH）等均为分析纯，水为重蒸水。

1.2仪器与设备

低速离心机：安徽中科佳科学仪器有限公司；高速离心机：上海力申科学仪器有限公司；立式自动压力蒸汽灭菌器：致微（厦门）仪器有限公司；生化培养箱：上海精宏实验设备有限公司；旋转蒸发仪：上海申上科技有限公司；紫外可见分光光度计：上海美谱达仪器有限公司；循环水真空泵：开封市宏兴科教仪器厂；电热恒温水浴锅：上海精宏设备有限公司；SW-CJ-2FD型单面净化工作台：苏州净化设备有限公司；电热恒温鼓风干燥箱：上海精宏实验设备有限公司等。

1.3方法

1.3.1牛奶仔根多糖样品的制备

牛奶仔根粉末用40倍水95℃水浴浸提30 min，重复3次，抽滤将提取液与残渣分离，提取液用旋转蒸发仪浓缩至一定体积，加入1/4体积的 Savage试剂，强烈振摇30 min。静置过夜后分层，离心除去交界处变性蛋白，重复处理3次脱蛋白，再加入3倍体积的95%的乙醇，4℃醇沉过夜，离心，沉淀物60℃烘干至恒重得牛奶仔根粗多糖。

1.3.2牛奶仔根多糖的抗氧化能力实验

（1）清除OH能力的测定利用Fenton反应产生·OH，·OH氧化水杨酸产生有色物质，该物质在510 nm处有强吸收峰。体系中加入清除·OH的物质，则会减少有色物质生成，降低吸光度[11]。称取牛奶子根粗多糖粉末0.1 g，用蒸馏水配制成1 mg/mL母液，并进行梯度稀释，配制浓度为0.05 mg/mL、0.1 mg/mL、0.2 mg/mL、0.5 mg/mL、1 mg/mL溶液，取若干支25 mL比色管，分别加入9 mmol/L FeSO40.25 mL、9.0 mmol/L水杨酸-乙醇溶液0.25 mL，以上不同质量浓度的牛奶仔根多糖溶液5 mL，最后加入8.8 mmol/L H2O20.25 mL启动反应，于室温下反应1 h[15]。试验设一个样品组和两个对照组，对照组1中用蒸馏水代替样品，对照组2用蒸馏水代替显色剂[10]。计算多糖对·OH的清除率。

清除率=[1-（Ai-A2）/A1]×100%]

式中：A1是对照组1的吸光度；Ai为样品组吸光度；A2为对照组2的吸光度。

（2）清除DPPH的能力的测定 利用DPPH·乙醇溶液在517 nm波长处有特征吸收峰，加入抗氧化剂后，在517 nm波长处吸光度的下降表示抗氧化剂对DPPH的清除能力[9]。准确称取0.010 0 g DPPH溶解在无水乙醇中，用250 mL棕色容量瓶定容，放入冰箱中备用。将牛奶子根多糖样品配制成浓度分别为0.2 mg/mL、0.4 mg/mL、0.6 mg/mL、0.8 mg/mL、1.0 mg/mL的牛奶子根多糖溶液。在2 mL的DPPH醇溶液中加入2 mL样品溶液，混匀避光30 min。按（1）节计算方法计算清除率。采用邻苯三酚自氧化法[12]，在10 mL试管中加入3 mLTris-HCl缓冲液（pH= 8.2），分别加入1 mL浓度为0.01 mg/mL、0.05 mg/mL、0.2 mg/mL、0.25 mg/mL、0.5 mg/mL的牛奶仔根多糖溶液，（25±0.5）℃水浴平衡20 min后，加入0.3 mL7.0 mmol/L的邻苯三酚准确反应4 min，加入1 mL 10.0 mol/LHCl终止反应，在420 nm处测定其吸光度A[15]。按（1）节计算方法计算清除率。

1.3.3牛奶仔根多糖的抑菌实验

（3）清除o2能力的测定预先将枯草芽孢杆菌、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌菌种分别接入相应的斜面培养基上进行活化。然后分别挑取1环已经活化好的菌种放入无菌水中，振荡摇匀，调整菌浓度约为105～107CFU/mL，备用。

（1）供试菌种的活化及菌悬液的制备采用滤纸片法[13]。滤纸打成直径为6 mm的小纸片，121℃湿热灭菌20 min。粗多糖用蒸馏水配成0.05、0.1、0.2、0.5、1 mg/mL等一系列浓度的溶液，在试验前用微孔过滤器（0.45 μm）除菌。将制好的滤纸片无菌状态下于各浓度牛奶仔根多糖溶液中浸泡30 min备用。同法用无菌水做阴性对照。

倒入细菌的固体培养基，待其完全凝固后，再分别移取各菌悬液0.2 mL，用涂布棒涂布均匀。每个平板放各溶液浸泡过的滤纸片3片（空白用无菌水浸泡过的滤纸片），用无菌镊子取样片贴放于平板表面。各样片中心之间间距30 mm以上，与平板的周缘相距15 mm以上。贴好后用无菌镊子轻压样片，使其紧贴于平板面上，盖好平皿，倒置，37℃恒温培养过夜。

（2）抑菌活性的测定

2　结果与分析

2.1抗氧化实验结果

2.1.1牛奶仔根多糖对·OH清除作用的测定测定牛奶仔根多糖对·OH的清除能力，以相应浓度的Vc对照，试验结果如图1所示。

图1　牛奶仔根多糖与Vc对·OH的清除作用的比较

由图1可知，在实验质量浓度为0.05～0.1 mg/mL范围时，对照品Vc对·OH的清除作用呈现明显的量效关系，在Vc浓度大于0.1 mg/mL时，Vc对·OH的清除作用大于99%，表明Vc对·OH具有较强的清除作用。而牛奶仔根多糖对·OH的清除作用一般，在实验质量浓度为1.0 mg/mL时，对·OH的清除率为44.2%。

2.1.2牛奶仔根多糖对DPPH清除作用的测定

测定牛奶仔根多糖和Vc对DPPH的清除能力，试验结果如图2所示。

图2　牛奶仔根多糖和Vc对DPPH的清除作用的比较

图2表明，Vc溶液在研究浓度范围内对DPPH的清除程度均在95%左右，无明显变化。在0.2～1.0 mg/mL之间，随着牛奶仔根多糖浓度的提高对DPPH的清除作用也逐渐加强，呈现量效关系，多糖浓度达到0.6 mg/mL以上时，清除率已经超过60%，当多糖浓度上升到1 mg/mL时，清除率可达84.02%。

2.1.3牛奶仔根多糖对O2-·清除作用的测定 测定牛奶仔根多糖和Vc对O2-·的清除能力，试验结果如图3所示。

图3　牛奶仔根多糖对与Vc对O2-·清除作用的比较

由图3可知，在浓度小于0.05 mg/mL时，牛奶仔根多糖比对照品Vc对O2-·的清除作用具有更明显的清除作用，牛奶仔根多糖在浓度为0.01 mg/mL，清除率即达到43.56%，在多糖浓度为0.5 mg/mL时清除率可达72.09%。

2.2牛奶仔根多糖的抑菌活性

由滤纸片扩散法测定抑菌活性的实验结果如表1所示。

表1　牛奶仔根多糖对各菌种的抑菌圈直径

由表1可知，牛奶仔根多糖提取液对枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌均具有一定的抑菌效果。当牛奶仔根多糖提取液浓度在0.05～0.1 mg/mL范围时，只对枯草芽孢杆菌具有一定的抑菌效果，而对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌无明显抑制作用；当多糖浓度大于0.2 mg/mL时，对三种细菌均具有一定的抑制作用，抑制效果为：枯草芽孢杆菌＞金黄色葡萄球菌＞大肠杆菌。

3　结语

自由基是需氧生物生命活动过程中多种生化反应的中间代谢产物。当其产生过量或清楚过慢时，会造成生物体的各种损伤。由试验结果可知，牛奶子根多糖清除效果虽弱于Vc，但对自由基还是具有明显的清除能力。牛奶子根多糖在体外对·OH、DPPH、O2-·均具有一定的清除作用。在牛奶仔根多糖浓度为1.0 mg/mL时，对·OH、DPPH的清除率分别为44.2%、84.02%，浓度为0.5 mg/mL时，对O2-·的清除率为72.09%，可见清除DPPH、O2-·的能力强于清除·OH的能力。因此牛奶子根多糖能够有效清除自由基，阻断自由基反应链，具有一定的抗氧化和防衰老的作用，可作为清除人体系统内自由基的抗氧化物[14]。

多糖对于各类微生物的生长的作用机制目前尚不明确。试验表明，牛奶仔根多糖对枯草芽孢杆菌、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌具有较为良好的体外抑菌活性，并表示出一定的剂量依赖关系。牛奶仔根多糖溶液浓度在0.05～0.1 mg/mL时，对枯草芽孢杆菌具有明显的抑制作用，对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌的抑菌作用不明显；但当多糖浓度大于0.2 mg/mL时，对枯草芽孢杆菌等三种细菌均具有一定的抑制作用，抑制效果为：枯草芽孢杆菌＞金黄色葡萄球菌＞大肠杆菌。

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中图分类号：Q949.761.2

文献标识码：A

文章编号：1674-2109（2015）06-0035-04

收稿日期：2015-04-17

基金项目：福建省大学生创新训练项目（201310397026）。

作者简介：吴美（1991-），女，汉族，在读本科生，主要研究方向：生物工程。

通讯作者：张敏（1972-），男，汉族，讲师，主要研究方向：化工新材料。

Antioxidant and Antimicrobial Activities of Elaeagnus umbellata Thunb.Polysaccharides

WU Mei，ZHANG Min
（Fujian Provincial Key Laboratory of Eco-Industrial Green Technology,Fujian Higher Education Institutions Key Laboratory of Green Chemistry and Technology,School of Ecology and Resource Engineering，Wuyi University,Wuyishan，Fujian 354300）

Abstract：Polysaccharide in Elaeagnus umbellata Thunb.was extracted by water extraction and ethanol precipitation in this study.The polysaccharide was further purified and its antioxidant and antimicrobial activities were investigated.The results showed that the polysaccharide from Elaeagnus umbellata Thunb.could significantly decrease the DPPH and superoxide anion radical.The decreasing rate of DPPH and superoxide anion radical could arrived at（84.02±2.84）%and（72.09±5.24）%respectively.However,the polysaccharide had little scavenging effect on·OH and the decreasing rate could arrived at（44.2±2.72）%.Furthermore,it was found that the polysaccharide could inhibit the growth of Bacillus subtilis and Staphylococcus aureus and Escherichia coli.And the inhibitory effect on Bacillus subtilis and Staphylococcus aureus was more significant than that on Escherichia coli.

Key words：Elaeagnus umbellata Thunb；polysaccharide；antioxidant activity；antimicrobial activity