柑橘皮中GSH的复合酶法提取及荧光检测

蒋景龙（陕西理工学院生物科学与工程学院，陕西汉中723001）

柑橘皮中GSH的复合酶法提取及荧光检测

蒋景龙
（陕西理工学院生物科学与工程学院，陕西汉中723001）

摘要：研究复合酶法提取柑橘皮中还原型谷胱甘肽（GSH）的工艺条件，以邻苯二甲醛（OPA）与GSH反应形成荧光体系，荧光光度法测定GSH含量。结果表明：柑橘皮中GSH的最佳提取工艺为：料液比1∶40（g/mL）、温度50℃，时间90min，pH 5.0，柑橘样品GSH提取量为9.06mg/kg。在最佳提取条件下，分别提取了日南1号、兴津、沙田柚、山下红、金桔、朱红橘、宫川、泛亚皇后、泛亚冰糖和城固冰糖中的GSH，荧光光度法测定GSH的提取量为7.81mg/kg～13.39mg/kg。荧光光度法的回收率达96.7%～99.3%，满足测定准确度的要求。

关键词：柑橘；还原型谷胱甘肽；邻苯二甲醛；荧光分光光度法

谷胱甘肽（Glutathione，GSH）是体内重要的内源性抗氧化剂，对氧化应激和免疫功能具有重要的调节作用[1-2]。GSH具有抗肿瘤、抗氧化、保肝、抑制艾滋病病毒保护机体免受艾滋病病毒的侵害等多种生物功效[3-5]。GSH作为生物活性添加剂应用在保健食品中在强化食品风味的同时对人体有保健作用，它在食品加工业中的应用前景显然要优于其它防腐剂或抗氧化剂。中国产业信息网发布的《2015-2020年中国注射用还原型谷胱甘肽行业运营态势及未来前景预测报告》指出，截止2015年，中国GSH还不能完全满足市场的需求，主要依靠进口，因此GSH的研究是人们关注的焦点。而且，植物对重金属的解毒和忍耐能力大多与植物中的GSH等化合物有关[6-7]，许多研究者都利用柑橘皮作为原料制备吸附剂对重金属污染的水体进行处理[8]，然而柑橘皮GSH含量检测鲜见报道。本文采用复合酶法提取10种柑橘中的GSH，并用荧光法测定了其中GSH的含量，以期为柑橘中GSH的提取及检测方法提供参考。

1材料与方法

1.1材料与仪器

本试验用柑橘均由陕西省城固县郭家山泛亚柑橘种植基地提供。GSH标准品：Sigma公司；以邻苯二甲醛（OPA）：上海五联化工厂；木瓜蛋白酶1.3× 10-5kat/mg、纤维素酶3×10-5kat/mg、果胶酶1.7× 10-5kat/mg：上海源叶生物科技有限公司；磷酸盐缓冲液（PBS）的配制及其他试剂均为分析纯；三次蒸馏水。

Hitach F-4500荧光分光光度仪：日本日立公司；Rotina 420R台式离心机：德国Hettich科学仪器公司；DHG电热鼓风干燥箱：上海一恒科学仪器有限公司；FE20PH计：Mettler Toledo；CLF-06C新型密封式粉碎机：浙江温岭创力药材器械厂；JXL-2S-6A数显恒温水浴锅：江苏金坛金祥龙电子有限公司；超纯水仪：四川优普超纯科技有限公司。

1.2方法

1.2.1溶液的配制

1.2.1.1GSH标准系列溶液配制

准确称取GSH标准样品10mg，加水溶解后于100mL容量瓶中定容，即为100mg/L的储备液；量取5mLGSH储备液，加水定容到100mL，即得5mg/L的标准溶液。吸取该标准溶液0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2m L，分别置于10mL容量瓶中，以0.02mol/LPBS（pH 8.0）定容，配制成浓度为0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6mg/L的系列溶液。

1.2.1.2OPA溶液的配制（20 g/L）

准确称取OPA 0.5 g，在25mL容量瓶中用适量甲醇溶解后，以0.02mol/LPBS（pH 8.0）定容。

1.2.2样品处理

新鲜柑橘手工剥皮，于50℃干燥箱中干燥，待柑橘皮恒重，粉碎过0.3mm筛，密封备用。

1.2.3最佳检测波长的确定及线性关系考察

准确吸取5mL浓度为0.6mg/L的GSH标准溶液与100μL 20 g/LOPA溶液反应，20min后将此溶液放入荧光分光光度计中进行发射波长（EM）和激发波长（EX）的扫描。

准确吸取5mL浓度为0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6mg/L的系列标准溶液，加入100μL 20.0g/LOPA溶液，20min后测定GSH-OPA体系的荧光强度，以浓度为横坐标，荧光强度为纵坐标做标准曲线。

1.2.4柑橘样品中GSH提取

样品加入酶（木瓜蛋白酶、纤维素酶和果胶酶等比例混合，按每克样品中加10mg复合酶）、醋酸-醋酸钠缓冲液，恒温水浴提取，加热灭酶；选择影响复合酶提取法提取效果的料液比、温度、时间和pH 4个因素，每个因素设3个水平[9-10]，正交试验设计见表1。

表1 因素水平表Table 1　Table factor and level

将提取液8 000 r/min离心10min，取上清液作为供试品。测定时取1 m L供试品加入0.02 mol/L PBS （pH 8.0）定容至10mL进行测定。分别吸取以上提取液5mL，加入100μL 20 g/LOPA溶液，20min后测定GSH-OPA体系的荧光强度，荧光强度越强则GSH含量越高，反之则越低。

1.2.5柑橘GSH检测及回收率的测定

在最佳提取条件下，采用复合酶法对10种柑橘皮粉末中的GSH进行提取，按照1.2.4方法测定GSH含量；每种柑橘样液各取3份，每份5mL，分别加入0.3mg/L的GSH标准溶液，加入100μL 20 g/L的OPA溶液，20min后测定GSH-OPA体系的荧光强度、计算回收率。

1.3数据统计与分析

数据处理、回归分析及画图是使用Origin数理统计和画图软件。

2　结果与讨论

2.1最佳检测波长的确定及线性关系考察

波长扫描如图1，EX为345 nm，EM为425 nm。标准工作曲线的回归方程为y=2 918.5x+93.279，相关系数R2=0.999 3。

图1　激发波长及发射波长扫描光谱Fig.1　Excitation wavelength and em issionwavelength

2.2柑橘样品GSH的提取

正交试验结果见表2。

极差R大小为RC＞RB＞RD＞RA，即影响程度从大到小依次为：时间、温度、pH和料液比。最佳提取条件为A3B2C3D2，即料液比1∶40（g/mL），温度 50℃，时间90min，pH 5.0。根据最佳提取条件进行验证试验，测得GSH提取量为9.37mg/kg。

表2　复合酶提取法正交试验设计及结果Table 2　O rthogonalarray design for optim izingm ulti-enzym atic extraction and test results

2.310种柑橘中GSH含量测定

10种柑橘皮GSH检测结果及回收率见表3。

表3　10种柑橘皮中GSH的含量及回收率Table3　The contentand the recovery rateof reduced glutathione in 10Citrus peels

这10种柑橘皮GSH的提取量为（7.81±0.35）mg/kg～（13.39±0.61）mg/kg，结合GSH在自然界不同组织中的分布范围[10]，柑橘皮中GSH的含量几乎达到茄子、菠菜等蔬菜中的GSH含量[11-13]，柑橘果皮高于叶片中的GSH含量[14]，由结果可知也可看出，不同品种（系）柑橘皮GSH含量差异明显。柑橘皮作为生物吸附剂对金属离子的吸附是否与GSH有关？这一过程中可能存在一种作用方式，也可能几种机理同时作用。

3　结论

目前对GSH的提取大多采用热水提取法、超声波法和化学渗透法，但提取率较低（0.145%）[15]，本课题组对热水提取法、超声波法、化学渗透法、复合酶法提取GSH的方法进行了比较，结果发现，复合酶法明显提高了GSH的提取率，汉中10种柑橘皮中GSH的含量丰富。中国是柑橘生产大国，每年约有150万t左右的果皮资源，但目前少量药用外，大部分柑橘皮被作为垃圾丢弃。今后应加强对柑橘皮提取物的分离纯化及对其生物活性化合物结构的研究；同时，还应加强柑橘皮的药理活性研究，为进一步研究开发提供更多的理论参考。例如柑橘皮作为生物吸附剂为重金属废水的处理提供了一种经济可行的技术，它的原料来源广泛且廉价，可达到以废治废的效果，在此研究基础上，今后可进一步研究柑橘中谷胱甘肽的准确定性和定量分析、分离纯化及药理活性等问题。

参考文献：

[1]Richie J P Jr,Nichenametla S,Neidig W,et al.Randomized controlled trialoforalglutathione supplementation on body stores of glutathione[J].European journal of clinical nutrition,2015,54(2): 251-263

[2]Palazzolo D L,Ely E A.Arsenic Trioxide and Reduced Glutathione Act Synergistically to Augment Inhibition of Thyroid Peroxidase Activity In Vitro[J].Biol Trace Elem Res,2015,165(1):110-117

[3]Singh S.Cytoprotective and regulatory functions of glutathione S-transferases in cancer cell proliferation and cell death[J].Cancer Chemotherapy and Pharmacology,2015,75(1):1-15

[4]孙元珏,祁伟祥,姚阳.还原型谷胱甘肽与肿瘤化疗相关性肝损伤的防治[J].中国肿瘤,2015,24(1):57-63

[5]Helbing B,Overbeck J V,Lauterburg B H.Decreased release of glutathione into the systemic circulation of patients with HIV infection[J].European Journalof Clinical Investigation,1996,26(1): 38-44

[6]YADAV SK.Heavymetals toxicity in plants:an overview on the role of glutathione and phytochelatins in heavy metal stress tolerance of plants[J].South African Journalof Botany,2010,76(2):167-179

[7]胡朝华,张蕾,朱端卫.植物螯合肽的生物合成与解毒机制及在重金属修复中的应用前景[J].华中农业大学学报,2006,25(5): 575-580

[8]赵华,陈爱华,焦必宁,等.柑橘皮对重金属生物吸附的研究进展[J].食品工业科技,2011,32(12):532-536

[9]郭黎平,刘国良,张卓勇,等.荧光光度法测定大豆提取液中还原型谷胱甘肽[J].东北师大学报(自然科学版),2001,33(1):34-38

[10]陈丽娜.玉米胚谷胱甘肽提取及纯化技术的研究[D].长春:吉林农业大学,2007:12-26

[11]杨玲娟,董晓宁,王小芳,等.山黧豆中还原型谷胱甘肽的荧光检测[J].食品工业科技,2011,32(4):397-404

[12]李铉军,韩玲,朱爱花,等.邻苯二甲醛荧光衍生化法测定食用海藻中还原型谷胱甘肽[J].食品工业科技,2012,33(22):81-91

[13]金京实,沈丽,崔胜云.衍生化法测定山药中还原型谷胱甘肽(GSH)和总巯基(-SH)含量[J].食品安全质量检测学报,2013,4(4): 1155-1160

[14]甘海峰,刘可慧,傅翠娜,等.NaCl胁迫对不同柑橘砧木品种抗氧化系统的影响[J].生态环境学报,2010,19(1):183-187

[15]王鑫.玉米胚中谷胱甘肽分离纯化及抗氧化效果评价[D].哈尔滨:哈尔滨商业大学,2010:1-56

DO I：10.3969/j.issn.1005-6521.2015.19.013

收稿日期：2015-07-06

基金项目：陕西省科技厅自然科学基础研究计划项目（2014JQ3113）；陕西省教育厅自然科学研究项目（14JK1158）；陕西理工学院科研基金项目（SLGKY-41）

作者简介：蒋景龙（1980—），男（汉），讲师，博士，硕士研究生导师，主要从事柑橘相关研究工作。

Study on the Compound Enzym e Extraction of Reduced Glutathione from Citrus and Determ ination by Fluorometric M ethod

JIANG Jing-long
（Schoolof BiologicalScienceand Engineering，ShaanxiUniversity of Technology，Hanzhong723001，Shaanxi，China）

Abstract：Process conditions for compound enzyme extraction of reduced glutathione（GSH）from Citrus peel was developed，with use of o-phthalaldehyde（OPA）as a fluorescent reagent and the contents of GSH was determined by fluorescence spectrophotometry.The results showed that the optimum extraction technology of GSH from CITRUS peelwasas following：ratioofsolid to liquid 1∶40（g/mL），extraction emperatureof50℃，extraction duration 90 min and pH 5.0．The yield of GSH from Citrus peel samp le under these conditions was 9.06 mg/kg．GSH was extracted from Nichinan 1，Okitsu，Shatian pummel，Yamasaki，Cumquat，Zhuhongju，Miyagawa，Fanyahuanghou，Fanyabingtangju and Chenggubingtangju by compound enzymemethod under the optimized conditions，and the contentofGSH ranged from 7.81mg/kg-13.39mg/kg.The determination of GSH proceededwith the accurateand sensitivemethod with the recovery rangeof96.7%-99.3%.

Keywords：Citrus；reduced glutathione；o-phthalaldehyde；fluorospectrophotometry