面粉及面制品中过氧化苯甲酰的检测误区

韩焕美，何桂华，张爱霞，郑新华，陈晞，李晓明（济南出入境检验检疫局，山东济南250014）

面粉及面制品中过氧化苯甲酰的检测误区

韩焕美，何桂华*，张爱霞，郑新华，陈晞，李晓明
（济南出入境检验检疫局，山东济南250014）

摘要：建立了高效液相色谱法同时检测面粉及面制品中过氧化苯甲酰和苯甲酸的方法。采用Waters XTerra RPC18（4.6 mm×250 mm，5 μm）色谱柱，以乙腈-0.4%乙酸水溶液（60/40，体积比）为流动相；以1.0 mL/min的流速检测苯甲酸和过氧化苯甲酰（λ=230 nm）。在0.125 μg/mL～100 μg/mL范围内线性良好，最低检出限为0.5 mg/kg，加标回收率在90.8%～105%。模拟面粉的储存和熟制过程，发现面制品制备、熟化的过程中，过氧化苯甲酰能快速降解，熟制面制品中基本不能检测出过氧化苯甲酰，而且面制品在植物油中油炸，油脂中添加的抗氧剂与过氧化苯甲酰相互作用，生成可能有毒有害成分。总之，单纯检测面粉及面制品中的过氧化苯甲酰对保证面粉及面制品的质量是不恰当的。

关键词：过氧化苯甲酰；降解；抗氧化剂

过氧化苯甲酰（Benzoyl Peroxide，BPO）作为一种食品添加剂主要用来使小麦粉增白，俗称面粉增白剂。国际食品法典委员会与美国食品和药物管理局（FDA）对BPO作为小麦粉处理剂的作用解释是：后熟、漂白和防止霉变[1]。BPO的作用机理：在面粉中水和酶的作用下发生反应，释放出活性氧以氧化面粉中极少数带共轭双键的不饱和脂溶性色素即β-胡萝卜素和其他有色成分，使面粉中色素含量变少，白度增加，同时生成的苯甲酸，对面粉起防霉作用，此外对面粉还具有后熟作用[2-4]。BPO的风险目前仍有争议，欧盟、FDA和联合食品添加剂专家委员会等所依据的研究结果和科学事实是一致的，不同只在于对于其风险的评估和接受程度的差异。研究证实，过量食用BPO主要的危害包括破坏食品中的营养素，损害肝功能并能导致胆结石，BPO还是肿瘤发生的促进剂[4]。罗文海[5]等研究了不同浓度级别的BPO能明显降低血清睾酮的含量，它是大鼠雄性生殖功能的危险因素；BPO的剂量愈大，其降低血清乳酸脱氢酶含量的作用愈大，而血清乳酸脱氢酶也是测量雄性生殖功能的常用指标。张庆凤等[6-10]研究发现BPO可能降低大鼠的生殖功能和导致脾脏等脏器功能损伤，致癌性较高。因此，食品安全国家标准（GB 2760-2011）中将BPO从面粉处理剂的名单中剔除，并规定自2011年5月1日起面粉中禁止添加BPO。

目前，BPO的检测方法已经十分成熟，主要有高效液相色谱法（HPLC）、毛细管电泳法、气相色谱法、间接碘量法、紫外分光光度法等[11-12]，本实验室采用HPLC。自2010年至2013年6月30日，本实验室共检测BPO项目279批次，涉及十余种面粉制品见图1。

图1　近四年过氧化苯甲酰检测批次、样品类别及所占比例Fig.1　The total batch of BPO detection，classification and sample proportion in nearly four years

从图1可以看出，BPO检测种类、批次是逐年上升的，检出率均为0，但是，这并不能说明消费者日常食用的米面制品是没有添加BPO的。究其原因，可能有如下几点：1）本实验室检测的面粉及面粉制品是“绿色的”，没有添加BPO的（从统计学角度讲，这种可能性比较小）；2）添加的BPO与面粉的营养物质[13-15]（比如维生素、类胡萝卜素）发生化学反应生成其他产物；3）面粉及面制品中BPO受周围环境（如温度、光照等）的影响，降解成其他成分。从BPO的分子结构、化学性质、改良/漂白面粉制品的作用原理等方面推测，BPO的产物之一是苯甲酸。添加到面粉中的BPO由于受周围环境影响而发生降解，但是其残留量、降解产物、降解规律等尚不明确，本文将针对这些问题开展研究。

1　材料与方法

1.1试剂材料与仪器设备

乙腈（色谱纯）：默克化工技术有限公司；冰乙酸（分析纯）：国药集团化学试剂有限公司；苯甲酸标准品（1 000 μg/mL）：中国计量科学研究院；BPO标准品（纯度为98.0%）：上海安谱科学仪器有限公司；小麦粉；水：Milli-Q超纯水系统制备；BPO（化学纯）：上海中利化工厂助剂分厂。Agilent1260液相色谱仪（配有二极管阵列检测器）、Agilent1100液相色谱仪（配有荧光检测器）：美国安捷伦公司；分析天平（感量为0.1mg）：梅特勒-托利多公司；Milli-Q纯水器：美国Millipore公司；IKA-KS130型振荡器：德国IK公司；色谱柱：Waters XTerra RP-C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）。

1.2液相色谱分离条件

流动相：乙腈∶H2O（含体积分数0.4%的冰乙酸）为60∶40（体积比）；流速：1 mL/min；柱温：40℃；检测波长：230 nm；进样体积：10 μL。

1.3标准溶液配制

BPO标准溶液：精密称取BPO粉剂0.010 2 g置10 mL量瓶中，加乙腈适量使溶解，再加乙腈稀释至刻度，摇匀，使其浓度为1 000 μg/mL。

苯甲酸、BPO标准曲线：精确移取不同体积的标准溶液于10 mL量瓶中，用乙腈稀释至刻度，摇匀。制成质量浓度为 0、0.125、0.25、0.5、1、2、10、20、50、100μg/mL混合标准溶液系列。在设定色谱条件下，分别取10 μL进行HPLC分析，对照品苯甲酸、BPO及其混合溶液的色谱图如图2。

图2　苯甲酸和BPO的对照品色谱图Fig.2　Standard chromatograms of benzoic acid and BPO

1.4小麦粉前处理及测定

精密称取样品约5.00 g（粉末样品直接称取，固体样品需粉碎），加入20 mL乙腈，振荡40 min，静置，取上清液过0.45 μm滤膜后上机检测。

1.5储存环境和热加工对BPO残留量的影响

小麦粉添加约240 mg/kg的BPO试剂，搅拌均匀。将面粉放置在光照通风处储存（25℃，湿度50%），每隔1小时取3平行样，前处理后HPLC检测。将该面粉加水拌匀，发酵30 min后，去一半定型蒸熟；另一半于油脂中煎炸。冷却后，分别取样3平行，前处理后入HPLC检测。

2　结果与分析

2.1苯甲酸、BPO的标准曲线及最低检出限

苯甲酸的线性方程为y=55.772 96x+14.354 28，相关系数r=0.999 90；BPO的线性方程为y=54.471 26x+ 8.826 20，相关系数r=0.999 97。线性范围均为0.125 μg/ mL～100 μg/mL；最低检出限为0.5 mg/kg。将不同质量浓度的对照品色谱吸收峰的面积及对应保留时间归纳至表1。

表1　不同质量浓度的苯甲酸和BPO对照品色谱吸收峰的面积及对应保留时间Table 1　Absorption peaks’area and the corresponding retention time at different concentrations of standard benzoic acid and BPO

2.2温度对小麦粉中BPO残留量的影响

将准确称量的化学纯BPO粉剂于50 mL烧杯中，加入一定量乙腈溶解，然后转入50 mL容量瓶中，定容，质量浓度约为60 mg/mL，4℃储备待用。量取一定体积的BPO储备液于具塞圆底烧瓶中，加入乙腈稀释，其质量浓度约60 μg/mL。将其放置在60℃水浴中，每隔30 min取一次样液，冷却后过滤膜进行HPLC检测。选择水浴2 h时的乙腈溶液进行HPLC检测，能够有力证明BPO在乙腈溶液中的稳定性，如图3。

图3　化学纯添加剂BPO的色谱图Fig.3　Chromatograms of chemical additives of pure BPO

从图上不难看出，有6个色谱峰，保留时间分别为，3.26、3.62、4.40、10.63、12.22、14.93 min，其中3.62、 10.63min的吸收峰对应的是苯甲酸和BPO。在整个过程中，各个色谱吸收峰的面积及峰高变化较小，说明BPO在有机溶剂中有良好的热稳定性。但是，添加在食品中的BPO的实际环境是水相的，为此，本文将研究BPO在水相中的稳定性。

同样的，吸取一定体积的BPO储备液于敞口三角瓶中，加水稀释，使其质量浓度约为60 μg/mL。为了更接近实际，将三角瓶置于沸水中，每5 min取样一次，冷却后进行HPLC检测，截取15 min和35 min样液色谱图如图4A。

图4　沸水浴中不同时间段BPO溶液的色谱图（A）和苯甲酸-BPO吸收峰面积（B）的变化趋势Fig.4　BPO chromatogram at different time in a boiling water bath solution and benzoic acid（A）and BPO absorption-peak-area’（B）change trend

从图4A不难看出，BPO的水溶液在沸水浴15min 和35 min时的色谱图有明显不同，主要表现在3.26和3.62 min的吸收峰有明显增强，10.63 min的吸收峰消失。以苯甲酸和BPO的峰面积为纵坐标，以水浴时间为横坐标作图，得苯甲酸和BPO的浓度变化趋势（图4B）。分析苯甲酸吸收峰面积的变化趋势，可以推测，既使食用添加了BPO面粉及其制品，“入口”的可能已无BPO，但一定含有苯甲酸，这与张帆[17]等模拟的BPO热分解动力学结论基本一致。总之，在熟制面制品中检测BPO项目是不恰当的。根据BPO吸收峰面积的变化趋势可知，即使面粉中添加了一定量BPO（最大使用量60 mg/kg），在其熟制过程中，BPO能完全降解，担心BPO会危害人体健康是不必要的。

2.3储存环境和热加工对BPO残留量的影响

分析BPO的分子结构可知，即使在新鲜小麦粉中添加了一定量的BPO，受光照、空气、湿度等因素的影响，BPO自然降解一段时间，消费者实际购买到的面粉中可能已经不含BPO。为此，本人又模拟了面粉的储存和热加工过程，样品按照上文的前处理方法处理后进行HPLC检测，苯甲酸和BPO峰面积的变化趋势如图5。

图5　面粉在储存（A）和热加工熟制（B）过程中苯甲酸和BPO的变化趋势Fig.5　Trend of benzoic acid and BPO absorption-peak area in wheat flour within thermal processing

回收率在90.8%～105%。面粉储存过程中，苯甲酸和BPO含量的变化比较平缓，基本成线性；热加工过程中，苯甲酸和BPO的面积相对较小，应该是加了水分稀释了的缘故，BPO吸收峰面积基本成线性下降，这很容易理解，苯甲酸吸收峰面积成抛物线趋势变化，应该是部分苯甲酸溶解在水中的缘故。

2.4抗氧化剂对BPO残留量的影响

BPO是强氧化剂，油脂中的抗氧化剂，比如特丁基对苯二酚是还原剂，二者会发生什么反应呢？实际上，本人认为添加了过氧化苯甲酰的面粉制备油炸食品危害消费者健康的可能性较大，因为特丁基对苯二酚的氧化产物对人体的危害大大高于特丁基对苯二酚本身。为了探索BPO和特丁基对苯二酚的相互作用，将添加了已知浓度的BPO面粉在油（添加了已知浓度的特丁基对苯二酚）中煎炸，分别检测面制品中的苯甲酸及BPO和油脂中TBHQ的含量（依据GB/T 21927-2008《食品中叔丁基对苯二酚的测定高效液相色谱法》），结果如图6。

图6　油炸面片中BPO与苯甲酸的色谱图（A）和油脂中特丁基对苯二酚的色谱图（B）Fig.6　Chromatogram of BPO and benzoic acid in fried food（A）and of tert-butyl hydroquinone in oil（B）

油脂中特丁基对苯二酚的浓度降低了32.3%，加标回收率为101%；油炸面片中的BPO浓度降低了74.2%，苯甲酸浓度增加了106%，回收率分别为99.3%、91.6%。这些数据说明BPO和特丁基对苯二酚之间发生了氧化还原反应。

3　讨论与结论

在试验过程中，发现以下几个问题：1）分析苯甲酸和BPO对照品的色谱图，发现不同质量浓度梯度出现几个未知峰（表1）；2）BPO在水溶液中的浓度变化是分阶段成线性关系下降，但是苯甲酸的浓度在上升到一定浓度后基本保持不变，可能是因为苯甲酸部分挥发（图4）；3）面粉热加工的过程中，苯甲酸的浓度呈抛物线状，可能是因为BPO分解产物苯甲酸溶解在水中的缘故，这也可能是苯甲酸加标回收率偏低的原因之一（图5）；4）油脂食品中，BPO色谱图（图6A）中出现了许多未知峰；特丁基对苯二酚色谱图（图6B）出现了2个未知峰。分析数据，可得出以下结论：1）BPO属亚稳态化合物，受光照、空气、湿度等影响自身降解为苯甲酸，也有可能与面粉的营养成分比如维生素反应，自身被还原为苯甲酸（主要产物）；2）经过热加工的面制品，BPO残留量很低或已经消除；3）BPO可与油脂中的抗氧化剂发生反应。总之，面制品在储存和热加工过程中，BPO是很难稳定存在的，其降解规律，我们或许已窥得一二；但是，BPO与油脂中的抗氧化剂发生何种反应，生成何种产物，对人体健康的危险程度，还需要进一步的探索。

分析上文的数据，不难发现，既使面粉中添加了BPO，在实际检测过程中，以BPO为目标产物检测面粉或面制品中的BPO是不合适。首先，BPO的分子结构决定了其化学不稳定性，热、光、水等因素都是其分解的诱因；其次BPO作为面粉处理剂的作用机理也佐证了面粉及面制品中BPO能与面粉中的维生素发生反应，自身被还原成苯甲酸，这意味着BPO的含量不是恒定不变的；最后，由于油脂中抗氧化剂的普遍使用，BPO、抗氧化剂、油脂中的不饱和酸、面粉中的维生素等可能发生一系列复杂的化学反应，且不论生成的某种化合物是否具有生物毒性，部分BPO一定被还原成苯甲酸。总之，以BPO为目标物，定性或定量检测面粉，尤其是面制品中BPO的添加量是不恰当的。

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DOI：10.3969/j.issn.1005-6521.2015.24.037

收稿日期：2014-03-20

基金项目：山东出入境检验检疫局科技项目（SK201358）

作者简介：韩焕美（1983—），女（汉），工程师，博士，研究方向：食品添加剂检测。

*通信作者

Detecting Defect of Benzoyl Peroxide in Wheat Flour and Flour Products

HAN Huan-mei，HE Gui-hua*，ZHANG Ai-xia，ZHENG Xin-hua，CHEN Xi，LI Xiao-ming
（Jinan Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau，Jinan 250014，Shandong，China）

Abstract：A new method had been established to determine the benzoyl peroxide（BPO）and benzoic acid in wheat flour and its products in a rapid and accurate way by high performance liquid chromatography.Waters XTerra RP-C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）chromatographic column and the mobile phase of mixture of acetonitrile and water including 0.4%acetic acid（60/40）at 1 mL/min were used for the separation.UV-detection at 230 nm was adopted in measurements.The benzoyl peroxide and benzoic acid were shown to be linear in the range from 0.125 μg/mL to 100 μg/mL，and the limits of detection were 0.5 mg/kg.The recovery of the method was between 90.8%and 105%.Next，the processes of the storage and ripening of wheat flour had been simulated to know degradation law of BPO.The results indicated that the measurement of BPO in wheat flour products was not suited.In one side，BPO can be deoxidized to be benzoic acid and others by heated.In another side，it is too difficult to protect BPO from reacting with antioxidant in fried food prepared.In a word，there are defects in BPO measurements of wheat flour and its products，and it is working key in our experiment.

Key words：benzoyl peroxide；degradation；antioxidant