地黄毛状根的诱导及条件优化

刘连旺　张永清　祁建军等

摘要：以发根农杆菌Accc10060菌株侵染地黄外植体，研究不同菌液浓度、不同侵染时间和不同共培养时间对地黄毛状根诱导率的影响。结果表明，发根农杆菌Accc10060菌株可成功诱导出地黄毛状根，PCR检测发现发根农杆菌Ri 质粒rolC基因已整合到地黄基因组中并得到表达；单因素试验结果显示，在地黄毛状根的诱导过程中，诱导的最佳菌液浓度为OD600=0.6，最佳侵染时间为10 min，最佳共培养时间为4 d。

关键词：地黄；毛状根；发根农杆菌；诱导率

中图分类号：S567.23+9 文献标识号：A 文章编号：1001-4942（2015）01-0047-04

Abstract Agrobacterium rhizogenes Accc10060 was used to infect the explants of Rehmannia glutinosa， then the influences of different bacterial concentrations， infection times and different co-culture times on hairy root induction rate were researched. The results showed that the hairy roots of R. glutinosa could be induced by A. rhizogenes Accc10060， and PCR detection results indicated that the rolC gene in Ri plasmid of A. rhizogenes had integrated into the genome of R. glutinosa and been expressed. The results of single factor experiment showed that the best induction conditions of hairy roots were OD600 as 0.6， infecting for 10 minutes and co-culturing for 4 days.

Key words Rehmannia glutinosa Libosch； Hairy root； Agrobacterium rhizogenes； Induction rate

地黄（Rehmannia glutinosa Libosch）为玄参科多年生草本植物，以新鲜或干燥块根入药[1]，始载于《神农本草经》，味甘性寒，具有滋阴养血、清热凉血、补肾生津止渴等功效[2]。地黄是我国常用的大宗中药材，其有效成分梓醇具有泻下、保肝、强心、利尿和降血脂等作用。生产中地黄主要采用营养繁殖，传统的栽培模式存在连作障碍，致使其种质退化，主要表现为根茎变细，产量下降，质量变差，严重影响地黄的产量和品质[3]。近年来利用生物基因工程手段生产药用植物成为一条可行途径，利用发根农杆菌感染植株形成的毛状根体系生长快、易于培养、遗传稳定性强、合成次生代谢物质能力突出[4]，发展潜力巨大。据统计，目前国内外已对26科92种药用植物进行了毛状根的诱导研究，如丹参[5]、人参[6]、甘草[7]和石斛[8]等，但对地黄毛状根的研究才刚刚起步。本试验利用发根农杆菌Accc10060感染地黄外植体诱导其产生毛状根，PCR技术鉴定毛状根，在此基础上研究不同因素对地黄毛状根诱导率的影响，初步优化了毛状根的诱导条件，以期为地黄毛状根大量培养奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

地黄植株为本实验室自培育的85-5地黄无菌苗，发根农杆菌Accc10060由中国医学科学院药用植物研究所祁建军老师提供。

rolC引物由上海生工生物技术有限公司合成，Premix PrimeSTAR HS购自TaKaRa公司，植物组织常规提取试剂盒购自Tiangen公司，质粒提取试剂盒E.Z.N.A. Plasmid Mini Kit Ⅰ购自OMEGA公司。

1.2 试验方法

1.2.1 菌株的培养与活化 取低温保存的Accc10060菌株，无菌条件下接种于固体培养基（YEB+100 mg/L Rif）上，28℃暗培养48 h。挑取单菌落于YEB液体培养基中，28℃，200 r/min振荡培养，至菌液OD600为0.6左右。5 000 r/min离心10 min，收集菌体，并用等体积的MS液体培养基（无蔗糖）重悬，供侵染使用。

1.2.2 地黄毛状根的诱导与继代培养 挑选幼嫩、生长旺盛的地黄无菌苗叶片，将其剪成0.5 cm2的小块，接种于无激素的MS培养基上预培养2～3 d。将上述预培养后的外植体浸于制备的菌液中， 28℃，120 r/min振荡侵染10 min。侵染后用无菌滤纸吸干外植体表面多余菌液，转入MS固体培养基上黑暗条件下共培养。3～4 d后将共培养后的外植体置于液体培养基（1/2MS+600 mg/L AMP）中，120 r/min、15 min清洗2次，以洗去外植体表面残留的农杆菌，转入到除菌培养基（1/2MS+600 mg/L AMP）中，于25℃恒温培养箱中暗培养诱导发根，每7 d转接1次，连续除菌4～5次，直至无菌斑出现。待地黄外植体产生的毛状根长至2～3 cm时，挑选生长迅速、分化旺盛的根段转接于无激素的1/2MS固体培养基上，进行毛状根的继代培养。

1.2.3 地黄毛状根PCR检测 取完全除菌后的毛状根约1 g，用常规植物组织DNA提取试剂盒提取毛状根DNA，借助质粒提取试剂盒从5 mL过夜培养的菌液中提取质粒DNA，作为阳性对照，同时以非转化根的DNA作为阴性对照。根据文献[9]，合成rolC上游引物：5′-ATGGCGGAATTTGACCTATG-3′；下游引物： 5′-TTAGTTCCATCTGCCCATCC-3′。PCR反应体系25 μL，包括Premix PrimeSTAR HS 12.5 μL，上下游引物各0.5 μL，模板DNA 40 ng，ddH2O 10 μL。PCR反应程序：94℃预变性5 min；98℃10 s，56℃ 退火15 s，72℃延伸 1 min，共35个循环；最后72℃延伸10 min。扩增产物使用2.0%的琼脂糖凝胶电泳，EB染色，紫外成像系统下观察DNA条带并拍照。endprint

1.2.4 不同因素对地黄毛状根诱导率的影响 通过单因素试验，研究不同因素对地黄毛状根诱导率的影响，以筛选最佳的诱导条件。

菌液浓度的筛选：将菌液浓度OD600设为0.2、0.4、0.6、0.8，侵染时间为10 min，共培养时间为4 d。

侵染时间的筛选：将侵染时间设为0、5、10、15、20 min，菌液浓度OD600为0.6，共培养时间为4 d。

共培养时间的筛选：将共培养时间设为0、2、4、6 d，菌液浓度OD600为0.6，侵染时间为10 min。

10 d后统计毛状根诱导率，计算公式如下：

诱导率（%）=产生毛状根的外植体总数/接种的外植体总数×100。

2 结果与分析

2.1 地黄毛状根的诱导和培养

发根农杆菌Accc10060侵染后的地黄叶片可成功诱导出毛状根。外植体经除菌培养10 d后，出现生根现象，每个叶片基部一般可诱导出一条或几条毛状根。经继代除菌培养后的毛状根，接种于无激素的1/2MS培养基数天后，生长加快产生许多侧根，生长状况良好。

2.2 地黄毛状根的鉴定

以地黄毛状根的基因组DNA为模板，利用rolC基因的上下游引物进行PCR扩增检测。结果显示，从转化的地黄毛状根总DNA中扩增出特异性片段，该片段与Accc10060质粒DNA的扩增结果一致，而从未转化的地黄根中则未扩增出此片段（见图1），说明含有rolC基因的发根农杆菌Ri 质粒T-DNA部分片段已整合到地黄基因组中，并获得表达。

2.3 不同因素对地黄毛状根诱导率的影响

2.3.1 不同浓度菌液对地黄毛状根诱导率的影响 菌液浓度直接影响着农杆菌侵染效率，在一定范围内，菌液浓度越高，菌体在植物细胞上的附着率越高，越有利于毛状根的转化，但浓度过高会增加对外植体的伤害，导致其褐化死亡，转化效果不佳。由表1可知，当菌液浓度为OD600=0.6左右时，地黄毛状根诱导率达最高，菌液浓度过低或过高均不利于其诱导。

2.3.2 不同侵染时间对地黄毛状根诱导率的影响 适宜的侵染时间有助于发根农杆菌对寄主植物的附着和转化，从而提高诱导率。侵染时间过短，农杆菌不能对植物细胞进行充分附着；侵染时间过长，发根农杆菌易对外植体细胞造成伤害，且不利于后期的除菌培养。由表2可知，侵染10 min时地黄毛状根的诱导效果最佳，之后随着侵染时间的增加，诱导率逐渐下降。侵染时间为20 min时，后期除菌培养困难，外植体逐渐褐化，直至最终死亡。

2.3.3 共培养时间对地黄毛状根诱导率的影响 共培养时间通常是发根农杆菌将T-DNA转移到植物细胞内的时间，适当的共培养时间是农杆菌成功转化的关键。由表3可知，共培养时间在0～4 d 时，随着共培养时间的延长，地黄毛状根的诱导率逐渐升高；当共培养时间为6 d时，诱导率为0，菌株大量增殖，几乎覆盖了外植体的表面，外植体褐化程度较高，不利于毛状根的诱导。

3 结论与讨论

本研究利用发根农杆菌Accc10060菌株侵染地黄的叶片，可成功诱导出毛状根，且大多数毛状根的发根部位集中在形态学下端的叶脉切口表面，这与丹参[10]、何首乌[11]的毛状根诱导结果一致，分析可能与生长激素的极性运输与分布有关。结合PCR 检测技术，从地黄毛状根基因组中扩增出与rolC基因一致的特异性条带，表明发根农杆菌 Ri质粒的T-DNA已整合到地黄基因组中。

同时，通过对菌液浓度、侵染时间和共培养时间3个影响因素的试验，优化了地黄毛状根的诱导条件。李景滨等[12]研究发现，菌液OD600在0.8左右时，金铁锁毛状根的诱导效果最佳，本试验结果表明，地黄毛状根诱导的最佳侵染菌液浓度为OD600=0.6，说明不同植物对发根农杆菌的敏感性有所差异，选择合适的菌液浓度有助于提高转化率。农杆菌对外植体的侵染时间是遗传转化中的重要因素，侵染时间的长短与诱导率的高低有着直接关系。孙晶等[13]研究表明，北柴胡毛状根诱导的最佳侵染时间为20 min，本试验中适于地黄毛状根诱导的最佳侵染时间为10 min，两试验均表明，随着侵染时间的延长，后续除菌困难， 外植体褐化严重，不利于毛状根的诱导。共培养时间的长短与转化效率密切相关。共培养时间过短则不能完成T-DNA的转移与整合，导致转化效率很低；共培养时间过长，农杆菌的过度增殖会毒害外植体，导致植物材料的坏死，也不利于毛状根的诱导。杨蕊等[14]研究发现，共培养3 d时，杜仲毛状根诱导率最高，为73%，当共培养时间增长至 5 d时，诱导率明显下降。本研究表明，适于地黄毛状根诱导的最佳共培养时间为4 d。

此外，在毛状根诱导过程中发现，适当添加外源激素和乙酰丁香酮，有助于毛状根诱导率的提高。郭生虎等[15]研究发现，添加100 μmol/L乙酰丁香酮较未添加的对照组毛状根诱导率明显提高。周倩耘等[16]认为适宜浓度的IAA、IBA、NAA、2，4-D，均可不同程度地促进人参毛状根的生长以及皂甙的积累。

本研究初步建立了地黄毛状根的诱导培养体系，但由于发根农杆菌转化植物产生毛状根的过程较为复杂，影响因素众多，因此，更为详细的诱导条件有待进一步筛选优化。

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