硝酸钠浓度对雨生红球藻生长及虾青素积累的影响

邹宁　蔡雯雯　孙东红等

摘要 研究了0.15、0.30、0.75、1.50 g/L 4种不同硝酸钠营养浓度条件对雨生红球藻生长状况的影响，同时探究了该试验条件对雨生红球藻中虾青素起始积累期和后期积累量的影响，以寻找既能使雨生红球藻在氮源用尽后细胞密度达到或接近最大，同时又能最快直接进入虾青素积累阶段的硝酸钠营养添加浓度。试验结果表明，硝酸钠浓度为0.15 g/L时雨生红球藻细胞生长状况最好，细胞浓度最高可以达到5.19×105个/ml。此条件下细胞尚未停止生长即已有细胞开始积累虾青素，变红（培养的第23天）。使用有机溶剂萃取法以丙酮提取虾青素，硝酸钠浓度为0.15 g/L时，最终虾青素浓度达到19.136 mg/L，是其他硝酸钠浓度下的虾青素含量最大值。

关键词 雨生红球藻；硝酸钠浓度；虾青素；丙酮

中图分类号 S968.41+9 文献标识码 A 文章编号 0517-6611（2015）15-232-03

Effect of NaNO3 Concentrations on Growth of Haematococcus pluvialis and Astaxanthin Accumulation

ZOU Ning， CAI Wenwen， SUN Donghong et al

（College of Life Science， Ludong University， Yantai， Shandong 264025）

Abstract Effects of four different NaNO3 concentrations， 0.15， 0.30， 0.75， and 1.50 g/L， on growth of Haematococcus pluvialis and accumulation of astaxanthin were studied. The optimal NaNO3 concentration for growth of H. pluvialis and accumulation of astaxanthin， early as well as high content was determined when nitrogen is depleted. The extracting agent of astaxanthin is acetone in the process. The results showed that the optimal NaNO3 concentration was 0.15 g/L with 5.19×105 cells/ml the maximal cell density and 19.136 mg/L the maximal astaxanthin content， while the astaxanthin accumulation started at 23th day from the culture.

Key words Haematococcus pluvialis； Sodium nitrate content； Astaxanthin； Acetone

近年来，国内外对抗氧化产品的需求量在不断增加，天然虾青素作为目前已知的最强的抗氧化剂在抗癌、增强免疫力[1-3]等医药保健和绿色食品添加剂、化妆美容等相关行业的需求量不断攀升，国内外研究人员致力于天然虾青素产品研制，但虾青素的纯度和产量远不能满足市场需求。探究天然虾青素的高效生产、提取纯化工艺是亟待解决的问题。

天然虾青素的来源主要是细菌、原生动物、真菌、微藻和甲壳类动物，其中以利用真菌和藻类及甲壳类动物提取天然虾青素为主。目前，天然虾青素的主要分离纯化方法有：酶解法[4]、有机溶剂萃取法、层析法、高效液相色谱法等[5-7]，其中以有机溶剂萃取法的工业化应用最为广泛，后两者由于成本较高等诸多原因多应用于产品研发阶段。

雨生红球藻[8-9]（Haematococcus pluvialis Flotow）被誉为天然虾青素的“浓缩品”[10]，因此雨生红球藻生产天然虾青素的工艺也成了人们研究的热点[11]。虽然雨生红球藻比螺旋藻、小球藻等人类常用保健的微藻具有更强的抗氧化能力，但由于其自身营养阶段对光照强度敏感[12]、生長周期长等特点，使得养殖雨生红球藻的技术要求更高，所以雨生红球藻的大规模生产较困难，这就意味着雨生红球藻的商业化有着很大的发展前景。

雨生红球藻有2种细胞状态，即具有鞭毛的运动细胞和无鞭毛的厚壁孢子。它的繁殖方式为无性繁殖[13-16]和有性繁殖[17] 。雨生红球藻在多种逆境胁迫条件下能够大量并迅速地积累虾青素[18]，这是雨生红球藻的自我保护方式[19]。研究表明，雨生红球藻只在红色厚壁孢子阶段积累类胡萝卜素，且其中80%以上为虾青素[20]。

氮是蛋白质、核酸、磷脂的主要成分，是细胞质、细胞核和酶的组成部分，在植物生命中占有首要地位，被称为生命元素。在雨生红球藻生长过程中氮也是不可缺少的元素，一些国内外学者研究了氮对其生长的影响，但结果却不尽相同。Borowitzka 等认为，硝酸盐对雨生红球藻生长的效果好于铵盐[21]，然而，根据应巧兰等对797株雨生红球藻的研究表明，氨氮对雨生红球藻生长速率的影响是硝酸盐的1.5倍[22]。有关硝酸盐浓度的研究中，Borowitzka 等得出对雨生红球藻生长最有利的硝酸盐浓度范围是0.5～1.0 g/L[21]。而吴长斌等的研究结果与Borowitzka 等的研究相差甚远[22]。由于结果的不一致，近几年对氮素浓度的研究也是有关雨生红球藻生长与虾青素积累研究的热点问题之一[24-26]。

工业生产中生产工艺时间的缩短，必然带来较大的经济利益。笔者的研究目的便是探究能使雨生红球藻从生长阶段转入虾青素积累阶段的时间缩短的氮浓度条件。雨生红球藻的工业生产过程中氮源常有剩余，且这些未耗尽的氮源无法回收利用，或回收成本过高，因而造成资源和成本的浪费，故而该研究对于雨生红球藻生产虾青素的工艺时间的缩短以及成本投入的降低和利润的提高都有较大的指导意义。

笔者研究了4种不同的硝酸钠浓度（0.15、0.30、0.75、150 g/L）对雨生红球藻的生长及虾青素积累的影响，探究此4种试验条件中何种氮浓度条件下雨生红球藻在氮源耗尽后可立即进入虾青素积累阶段并最终获得较高细胞密度和虾青素积累量。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 藻种。

雨生红球藻（Haematococcus pluvialis Flotow），藻种由鲁东大学藻类研究所提供。

1.1.2 主要试剂。

次氯酸钠，硫代硫酸钠，柠檬酸铁，磷酸二氢钾，柠檬酸，EDTANa2 ，CaCl2， H3BO3，Na2MnO4·2H2O，ZnSO4，MnCl2·4H2O，CuSO4·5H2O。

1.1.3 主要仪器与设备。

UV4802H型分光光度计，尤尼柯（上海）仪器有限公司；

PHS3C型酸度计，上海雷磁仪器厂；

FY1HN型真空泵，浙江飞越机电有限公司。

1.2 方法

1.2.1 雨生红球藻培养基的配制。

使用BG11培养基，配制4个5 000 ml体系的培养基，并对4个体系作不同的处理，使其硝酸钠浓度分别为 0.15、0.30、0.75、1.50 g/L。

1.2.2 雨生红球藻培养条件的控制。

在室温条件下，将4组不同硝酸钠浓度的藻液放到日光下培养，pH范围7.5～90，刚开始藻种密度低时放在阳光不强的地方，以免光照太强藻种光氧化。用ACO系列电磁式空气泵通气，供以无机碳源。根据光合作用的原理每天日升前接通空气泵电源给藻液通气，日落后切断空气泵的电源，既可保证雨生红球藻生长过程中光合作用所需无机碳源的供应又可节约能源，提高了能源的利用率。

1.2.3 雨生红球藻生长测定。

雨生红球藻细胞密度测定采用血球计数板显微细胞计数法[21，23]。 细胞干重的测定采用分光光度法，使用分光光度计在674 nm下测雨生红球藻藻液的吸光度[27]，确定细胞干重和吸光度之间的关系。OD674 nm值和细胞干重之间的相关性标准曲线如图1所示。

1.2.4 虾青素的提取方法。

使用有机溶剂萃取法提取虾青素。研究表明，以丙酮作为萃取剂来提取虾青素的效果好于其他有机溶剂[28]，且根据鲁东大学生命科学学院实验室以往经验，丙酮萃取雨生红球藻中虾青素的效果要好于乙醇等其他有机溶剂，故该试验使用丙酮提取雨生红球藻中的虾青素。

取5 ml雨生红球藻在藻液离心后去除上清液，用丙酮分3次进行提取，之后将3次提取液合并并定容至10 ml，用分光光度计测定其OD473值。

1.2.5 虾青素的计算方法。虾青素含量计算公式如下：

虾青素含量（mg/L）=4×A475×丙酮的体积/样品体积[29]

据有关资料记载，虾青素在475 nm處有最高吸收波峰，由于仪器设备存在差异，经测定虾青素在该试验所用的分光光度计中最高吸收波峰为473 nm。故该试验所用公式为：

虾青素含量（mg/L）=4×OD473×丙酮的体积/样品体积

2 结果与分析

2.1 硝酸钠浓度对雨生红球藻密度的影响 雨生红球藻在不同硝酸钠浓度下从培养第0天至第102天内的细胞数目的变化如图2所示。由图2可以看出，在4个不同硝酸钠浓度下，雨生红球藻细胞的数量随着时间的推移均逐渐增多。在0～4 d时间内，各硝酸钠浓度下的细胞数量增长幅度相似，但从第4天之后，细胞数量的增长状况出现了差别。在7～12 d时，雨生红球藻生长进入对数期，硝酸钠浓度为0.15 g/L的反应器中所测得的细胞数目最多，为2.23×105个/ml；硝酸钠浓度为0.3和0.75 g/L的反应器中测得的细胞数目相似，为（2.1±0.1）×105个/ml；而硝酸钠浓度为150 g/L的反应器中测得的细胞数目最少。进入稳定期后，硝酸钠浓度为0.15 g/L条件下生长的雨生红球藻的细胞数目较平稳地高于其他三者，其细胞数目最终达到5.194×105个/ml。 0.75 g/L的硝酸钠浓度的反应器中雨生红球藻生长状况次之，细胞浓度最终为4.961×105个/ml。硝酸钠浓度为0.30 g/L的反应器中雨生红球藻的生长状况最差，细胞浓度为3.726×105个/ml。硝酸钠浓度为1.50 g/L的反应器中的细胞数目变化趋势线低于0.75 g/L的条件下的雨生红球藻细胞数目变化趋势线，但试验结束时细胞数达5.511×105个/ml。综合经济效益、生产效率等因素，从该试验的结果可见，推荐选用0.15 g/L硝酸钠浓度培养雨生红球藻。

2.2 硝酸钠浓度对雨生红球藻细胞干重的影响 由图3可以看出，随着培养时间的增加雨生红球藻的细胞干重呈上升趋势。前期4种硝酸钠浓度条件下生长的雨生红球藻都出现了细胞干重的快速增加的情况。培养约7 d后，不同硝酸钠浓度条件下生长的雨生红球藻的细胞干重出现了差异。试验最后，硝酸钠浓度为0.15 g/L的条件下生长的雨生红球藻细胞干重最高，为1.525 3 g/L； 硝酸钠浓度为0.30 g/L的条件下生长的雨生红球藻的细胞干重最低，为0.719 2 g/L；硝酸钠浓度为0.75 g/L条件下的雨生红球藻的细胞干重为0.757 6 g/L；硝酸钠浓度为1.50 g/L的条件下生长的雨生红球藻的细胞干重为0.949 9 g/L。

2.3 硝酸钠浓度对雨生红球藻中虾青素积累的影响

试验过程中的镜检结果表明，在雨生红球藻培养的第23天，即雨生红球藻生长进入稳定期后，硝酸钠浓度条件为0.15 g/L的反应器中的雨生红球藻即开始积累虾青素，细胞开始变红。虾青素最终含量达19.136 mg/L，占细胞干重的1.26%，高于其他试验条件下的虾青素含量（图4、5）。

图4所示为4种不同的硝酸钠浓度条件下的雨生红球藻最终的虾青素积累量。图5所示为4种不同的硝酸钠浓度条件下的雨生红球藻培养过程中虾青素积累的情况。硝酸钠浓度条件为0.30 g/L的反应器中的雨生红球藻最终虾青素含量为12.848 mg/L，占细胞干重的1.787%；硝酸钠浓度条件为0.75 g/L的反应器中的雨生红球藻最终虾青素积累量为15.872 mg/L，占细胞干重的2.09%；硝酸钠浓度条件为1.50 g/L的反应器中的雨生红球藻虾青素最终积累量为10.888 mg/L，占细胞干重的1.146%。

3 结论

在硝酸钠浓度条件分别为0.15、0.30、0.75、1.50 g/L，而其他培养条件相同的情况下，硝酸钠浓度为0.15 g/L的反应器中雨生红球藻生长状况最好，且在氮源耗尽后最先开始积累虾青素并获得最高的虾青素积累量，为19.136 mg/L，占细胞干重的1.26%。

目前，在雨生红球藻生产虾青素的工业中常使用的氮浓度条件为1.50 g/L，生产中未利用的氮回收困难，造成成本和资源的浪费。前人研究论文中所得培养雨生红球藻的最优氮浓度为0.75 g/L，该研究所得结论的最优硝酸钠浓度015 g/L，低于前人研究所得最优氮浓度，更是工业用1.50 g/L的氮浓度条件的1/10。

且在培养的第23天，硝酸钠浓度为0.15 g/L的试验条件下的雨生红球藻先于其他3个试验条件下的雨生红球藻进入虾青素积累阶段，并最终获得该试验条件下最高的虾青素积累量，19.136 mg/L，是1.50 g/L硝酸钠浓度条件下虾青素积累量的1.758倍，是0.75 g/L的硝酸钠浓度条件下虾青素积累量的1.206倍。

该试验得出的雨生红球藻培养所需硝酸钠浓度低于工业用氮浓度和前人研究所得培养雨生红球藻的最优氮浓度条件，对雨生红球藻生产工艺上时间的缩短和成本投入的降低有一定参考意义。

参考文献

[1] NAKAYAWA K，KIKO T，MIYAZAWA T，et al.Antioxidant effect of astaxanthin on phospholipid peroxidotion in human erythrocytes[J].British Journal of Nutrition，2011，105（11）：1563-1571.

[2] 肖素榮，李京东.虾青素的特性及应用前景[J].中国食物与营养，2011，17（5）：33-35.

[3] CHEWA B P，MATHISONA B D，HAYEK M G，et al.Dietary astaxanthin enhances immune response in dogs[J].Veterinary Immunology，2011，140（3/4）：199-206.

[4] NAGAO T，FUKAMI T，HORITA Y，et al.Enzymatic enrichment of astaxanthin from Haematococcus pluvialis cell extracts[J].JAOCS，2003，80（10）：975-981.

[5] 董建勇.天然药物化学[M].杭州：浙江大学出版社，2011：22-30.

[6] 黄萌.南极鳞虾中虾青素的提取与纯化[D].济南：山东师范大学，2012.

[7] 牟志春，张明，张艺兵，等.高效液相色谱法快速鉴别人工合成虾青素养殖的三文鱼[J].食品科学，2009，30（22）：318-320.

[8] JOTSHI C K，HSIEH C K.Thermal storage in ammoniumalum/ammoniumnitrate eutectic for solar space heating applications[J].Journal of Solra Energy，1998，120（2）：20-24.

[9] 凌善锋.雨生红球藻培养基和诱导条件优化[J].江苏农业科学，2013，41（11）：266-267.

[10] 谢英彪.欧美流行营养补充剂[M].南京：江苏科学技术出版社，2012：22-36.

[11] 刘建国，刘伟，COHEN Z，等.雪藻高密度连续培养中生物量和花生四烯酸的高产率[J].海洋与湖沼，2002，33（5）：499-508.

[12] 韦韬，顾文辉，李建，等.雨生红球藻的光周期效应[J].植物学报，2013，48（2）：168-173.

[13] 邱保胜，刘其芳.红球藻研究进展[J].水生生物学报，2000，24（5）：546-554.

[14] 刘建国，殷明焱，张京浦，等.雨生红球藻细胞周期初探[J].海洋与湖沼，2000，31（2）：145-150.

[15] KOBAYSHI M.Morphological changes in the life cycle of the green alga Haematococcus pluvialis[J].J Fermentation and Bioenginerig，1997，84（1）：94-97.

[16] LEE Y K，DING S Y.Cell cycle and accumulation of astaxanthin in Haematococcus lacustris（Chlorophyta）[J].Journal of Phyeology，1994，30（3）：44-59.

[17] 成永旭.生物饵料培养学[M].2版.北京：中国农业出版社，2005：47.

[18] 张睿钦.雨生红球藻细胞转化及虾青素的提取[D].青岛：中国海洋大学，2012.

[19] TJAHJONO A E，HAYAMA Y，KAKIZONO T，et al.Hyperaccumulation of astaxanthin in a green alga Haematococcus pluvialis at elevated temperatures[J].Biotecnology Letters，1994，12（2）：133-138.

[20] LORENZ R T，CYSEWSKI G R.Commercial potential for Haematococcus microalgae as a natural source of astaxanthin[J].Tibtech Appil，2000，18（4）：160-167.

[21] BOROWITZKA M A，HUISMAN J M，OSBORE A.Culture of the astaxanthin producing green alga Haematococcus pluvialis，1.Effects of nutrients on growth and cell type [J].Appl Phycol，1991，3（4）：295-304.

[22] 应巧兰，叶勇.影响雨生红球藻797株生长和虾青素积累的某些因素[J].应用与环境生物学报，2002，8（1）：56-60.