副猪嗜血杆菌云南流行毒株的分离与鉴定

陈关雄　姜学云　台晓媛等

摘要 [目的] 了解云南省副猪嗜血杆菌流行毒株的生化特性。[方法] 采集10頭6月龄疑似猪传染性副猪嗜血杆菌病的病猪样品， 用巧克力培养基进行细菌的分离与培养，并对分离菌株进行细菌的形态观察、培养特性和生化试验鉴定。[结果] 成功分离出1株副猪嗜血杆菌，该分离株不需要X因子，但需要V因子。分离菌株被鉴定为副猪嗜血杆菌，从而将此病例确诊为副猪嗜血杆菌病。[结论] 该研究可为进一步控制副猪嗜血杆菌的危害奠定基础。

关键词 副猪嗜血杆菌；分离；鉴定；生化特性

中图分类号 S858.28 文献标识码 A 文章编号 0517-6611（2015）15-159-02

Isolation and Identification of Epidemic Strains of Swine Heamophilus parasuis in Yunnan Province

CHEN Guanxiong1，JIANG Xueyun2，TAI Xiaoyuan3，ZHU Lingyun5* et al

（1. Animal Husbandry and Veterinary Station in Shilin County of Yunnan Province， Shilin， Yunan 652200； 2. Comprehensive Agricultural Service Center of Xijiekou Town in Shilin County of Yunnan Province， Shilin， Yunan 652209； 3. Comprehensive Agricultural Service Center in Dake Township of Shilin County，Yunnan Province，Shilin，Yunan 652202；5. College of Animal Science and Technology， Yunnan Agricultural University， Kunming， Yunan 650201）

Abstract [Objective] The research aimed to understand the biochemical characteristics of epidemic strains of swine Heamophilus parasuis in Yunnan Province. [Method] The diseased samples were collected 10 heads of suspected swine infected with H. parasuis. The pathogen was isolated and cultured with chocolate medium. And the isolated strain was identified by using morphologic observation， culture characteristics and biochemical tests. [Result] One strain of H. parasuis was successfully isolated. This isolated strain didnt need X factor， but it needed V factor. [Conclusion] The research laid the foundation for controlling the damage of H. parasuis further.

Key words Heamophilus parasuis；Isolation； Identification；Biochemical characteristics

副猪嗜血杆菌病（Haemophilus parasuis，Hps）又称为猪革拉斯氏病（Glassers disease），常引起猪的多发性浆膜炎和关节炎，曾被认为是由应激所引起的散发性疾病，后来被证实是由副猪嗜血杆菌所引起[1]。副猪嗜血杆菌可以影响从2周龄到4月龄的青年猪，主要在断奶后和保育阶段发病，通常见于5～8周龄的猪，发病率一般为10%～15%，严重时死亡率可达50%[2]。

随着世界养猪业的发展，该病已成为全球范围内影响养猪业的典型细菌性疾病[3]。在我国，由于饲养技术的调整不当以及突发新的呼吸道综合征，使得该病日趋流行，危害日渐严重。近年来，我国各猪场发生多发性浆膜炎和关节炎的报道屡见不鲜，其中不少病例的病原被初步诊断为副猪嗜血杆菌，但限于生产条件，极少有人对其进行确切诊断，因此有必要对其进行实验室研究，确定其生物特性。

笔者从具有典型临床症状的病猪的肺脏心包积液和关节液等病料中取样，采用常规细菌分离培养方法进行分离培养，对分离菌株进行生化鉴定，旨在为进一步研究副猪嗜血杆菌的形态特性、临床诊断和预防疫苗研究等奠定基础和实验室依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 病料来源。选择云南省10只6周龄出现发热、咳嗽、呼吸困难、跛行、消瘦的病猪进行试验。

1.1.2 主要试剂。鲜血琼脂、巧克力琼脂、营养琼脂、牛肉浸液、猪胃浸液、胎牛血清、NAD、氯化钠、蛋白胨、琼脂粉、葡萄糖、蔗糖、乳糖、半乳糖、菊糖、果糖、麦芽糖、鼠李糖、多价蛋白胨、磷酸氢二钾、磷酸二氢钾、尿素、VP试剂和MR试剂等，均由动物医学实验室教学中心提供。

1.1.3 主要仪器。恒温培养箱、高压蒸汽消毒器、超净工作台、双重纯水蒸馏器等均由云南农业大学动物医学实验室教学中心提供。

1.2 方法

1.2.1 病料内细菌的分离培养。采用直接分离培养法，将病料在巧克力琼脂培养基上涂抹后，进行常规划线分离，置于37 ℃恒温箱培养24～48 h，挑取可疑菌落作纯培养；挑取培养物到普通琼脂上，观察是否生长[4]。

1.2.2 生化试验。

1.2.2.1 V因子试验。可疑菌落接种到加有V因子和未加V因子的马丁肉汤培养基上，置于37 ℃恒温箱培养24～48 h，观察是否长出菌落。

1.2.2.2 X因子试验。挑取可疑菌落接种血琼脂平板上，再用金黄色葡萄球菌在分离菌株划线中间点4个点，置于37 ℃恒温箱培养24 h后，观察菌落长势、葡萄球菌的溶血圈大小以及有无卫星现象。

1.2.2.3 糖发酵试验。分离菌株接种于葡萄糖、麦芽糖、果糖、半乳糖、鼠李糖、乳糖、蔗糖、菊糖和尿素等發酵管中，置于37 ℃恒温箱培养24 h后，观察发酵管颜色变化。

1.2.2.4 MR试验。分离菌株接种于甲基红培养基（培养基中加有NAD血清、牛肉浸液、猪胃浸液）中，置于37 ℃恒温培养24 h，滴加甲基红指示剂2滴，观察反应结果。若出现玫瑰红色反应则为阳性，若出现黄色或不变色则为阴性。

1.2.2.5 VP试验。按照Barritt氏法，将分离菌株接种到葡萄糖蛋白胨水培养基（培养基中加有NAD血清、牛肉浸液、猪胃浸液）中，37 ℃恒温培养24～48 h。按照甲液（6% α萘酚乙醇/ml）∶乙液（40% 氢氧化钾）=3∶1，混合后37 ℃水浴30 min观察结果。若呈红色则为阳性反应；若为阴性应继续水浴4 h再进行观察，若仍为阴性则判为阴性。

2 结果与分析

2.1 病原菌的分离培养 经过培养箱培养24 h，巧克力培养基上长出形态不同的3种菌落，其中1种菌落形态与副猪嗜血杆菌菌落形态相似，在营养琼脂和血琼脂上无法找到，该菌落呈圆形，表面光滑，边缘整齐、灰白色、大头针针帽大小（图1）。经过查阅资料和染色镜检，发现它符合副猪嗜血杆菌的形态和染色特征[5]。

2.2 分离菌株的镜检及染色结果 经革兰染色可见到革兰阴性细小杆菌，细菌为细丝状，多单个存在，个别呈两极浓染的球杆状，中间有长而弯曲的丝状菌体，菌体形态表现明显的多形性[6-8]（图2）。

2.3 生化鉴定结果

2.3.1 V因子试验。经过培养发现，接种加有V因子的马丁肉汤培养基经过培养上长出圆形、表面光滑、边缘整齐、浅黄色、大头针镇帽大小的菌落。

2.3.2 X因子试验。将分离菌株划线于血琼脂上，并在线条间点划葡萄球菌，结果发现越靠近葡萄球菌分离菌株长出的菌落越多，且葡萄球菌的溶血圈进一步放大（卫星现象）（图3）。

2.3.2 生化特性。由表1可知，分离菌株能利用葡萄糖、乳糖，半乳糖，不能利用蔗糖、 鼠李糖、菊糖、果糖和尿素等，需要V因子，不需要X因子，MR和VP试验结果均呈阴性。

3 讨论

笔者从患病猪肺中成功分离到1株副猪嗜血杆菌，该菌株不需要X因子，但需要V因子。分离结果与以前报道的副猪嗜血杆菌在鼻腔和气管中分离率较高[9-11]，肺脏中极少分离到这一结论不相符，可能是因为该研究是从具有典型病理变化的肺脏中分离的，该肺脏遭到副猪嗜血杆菌严重感染，肺脏中副猪嗜血杆菌数量较多。据此推断，具有典型病变的肺脏也可以作为该病原的分离培养病料。

副猪嗜血杆菌及其脆弱，容易死亡，该菌在4 ℃只能存活1周，至多存活20 d。因此，即使通过病料送检以PCR方法检测出该菌的特异DNA片段，仍无法获得具有生物活性的菌株，对该病的研究造成物质上的困难[12-15]。该试验分离的此菌株可以考虑具有典型病变肺脏作为材料。

疫苗的使用是预防副猪嗜血杆菌病最为有效的方法之一，但由于副猪嗜血杆菌具有明显的地方性特征，而且不同血清型菌株之间的交叉保护率很低，因此用地方菌株制备灭活苗可以有效控制副猪嗜血杆菌病的发生[14]，为进一步控制副猪嗜血杆菌的危害和提高养殖户的经济效益提供支持。

参考文献

[1] 薛国聪，徐成刚，涂玉蓉，等.副猪嗜血杆菌的分离鉴定与药敏试验[J].中国畜牧兽医，2010，37（1）：134-137.

[2] 车勇良，江斌，吴学敏，等.福建地区副猪嗜血杆菌的主要生物学特性[J].中国兽医科学，2012，42（12）：1237-1241.

[3] 陆承平.兽医微生物学[M].4版.北京：中国农业出版社，2007.

[4] 陈溥言.兽医传染病学[M].5版.北京：中国农业出版社，2006.

[5] 蔡旭旺.副猪嗜血杆菌的分离鉴定及诊断方法与灭活疫苗的研究[D].武汉：华中农业大学，2010.