含益生菌罗非鱼颗粒饲料的加工方式及贮存稳定性研究

王汗成　田丰伟　翟齐啸等

摘要 采用新鲜浓缩湿菌体、冷冻干燥菌粉和海藻酸钠微胶囊包埋的不同加工方式，将植物乳杆菌CCFM8661作为添加剂加入到颗粒饲料中，进行混合、制粒试验，探究其对益生菌活性的影响。结果表明，混合操作对3种不同益生菌添加方式下的活性影响不显著，而制粒操作后新鲜浓缩湿菌体组存活率为5.98%，冻干菌粉组存活率为2.56%，海藻酸钠包埋益生菌组存活率为24.01%。将3种不同益生菌添加方式的饲料与制粒后进行益生菌喷涂的饲料在4 ℃和室温（25 ℃）条件下进行2个月贮存试验。试验期间内各组在4 ℃下益生菌活性较为稳定，25 ℃条件下各组活性均有下降，海藻酸钠微胶囊组益生菌活性下降速度显著低于其他3组。这说明海藻酸钠微胶囊在制粒和后期贮存中显著保护了益生菌的活性。

关键词 植物乳杆菌；颗粒饲料；加工；贮存；活性

中图分类号 S963.72 文献标识码 A 文章编号 0517-6611（2015）15-154-05

Study of Tilapia Diet Pellet Containing Probiotic on Processing Methods and Storage Activity

WANG Hancheng， TIAN Fengwei*， ZHAI Qixiao et al

（School of Food Science and Technology， Jiangnan University， Wuxi， Jiangsu 214122）

Abstract Three processing methods， fresh concentrated bacterial， freeze dried bacterial powder and sodium alginate microcapsules were applied to add Lactobacillus plantarum CCFM8661 as feed additives to the tilapia diet pellet to explore how unit operations， the mixing and pelletization， influence the probiotic activity. The mixing has no obvious effects on the probiotic activity among three processing methods， however， the pelletization does. The survival rate of the probiotic is 5.98% through the fresh concentrated bacterial method after the pelletization， and that through the freeze dried bacterial method is 2.56%， and through the sodium alginate microcapsules method is 24.01%. Then different feeds made through the three methods and pelleted feed using probiotic spray coating were applied to take the storage experiment in 4 ℃ condition， and 25 ℃ for 2 months. The result indicates that all groups showed a steady probiotic activity in the 4 ℃ during the experiment. And in the 25 ℃， although the sodium alginate group showed a same decrease tendency， the rate of descent is significantly lower than other groups. The result indicated that the sodium alginate microcapsules protect the probiotic in the pelletization and storage.

Key words Lactobacillus plantarum； Diet pellet； Processing； Storage； Activity

乳酸菌是一類利用糖类进行代谢并产生乳酸的无芽孢、革兰氏阳性菌的总称，包括乳杆菌、乳球菌和双歧杆菌在内的23个属。乳酸菌广泛应用于食品、饲料和发酵领域，被认为是安全的食品微生物，是益生菌的主要来源[1]。根据不同的益生菌菌属和菌株特性，已经发现了乳酸菌在维持肠道菌群平衡、抑制致病菌[2]、增强免疫力、降低胆固醇[3]以及在缓解氧化[4]和重金属中毒[5-6]等方面产生了重要的作用。

随着益生菌的开发和研究，越来越多的菌株应用在水产行业，将益生菌作为饲料添加剂，在肠道内通过调节肠道菌群及其代谢产物的作用，拮抗致病菌，可以有效防治疾病，提高免疫力[7-9]，促进进食和生长[10-11]。将乳酸菌作为饲料添加剂在吉富罗非鱼[12]、奥尼罗非鱼[13-14]、草鱼[15]、牙鲆稚鱼[16]和南亚野鲮[7]等中应用，取得了显著的效果。研究表明，乳酸菌能促进水产动物的孵化，提高幼鱼的存活率[17]，并对斑马鱼的骨骼发育和性别分化产生促进作用[18]。然而，将乳酸菌应用于商业化生产中，必须要经过高温高压环境的制粒加工且菌体必须要在保存期内保持活力才能在最终饲喂中发挥其作用。一般的乳酸菌并不能够耐受制粒加工的高温，但不同乳酸菌对热的耐受性不同[19]。在混合和压粒的过程中，机械挤压与高温使蛋白质变性，酶和微生物失活。失活的程度与温度、压力、水分、微生物的特性和保护剂的性质有关[20]。大多数乳酸菌在达到80 ℃时存活率较低，仅有几种芽孢杆菌能够耐受此加工温度[21]。因此，在商业中使用乳酸菌，乳酸菌的抗逆性研究是非常值得关注的问题[19]。

研究表明，嗜温微生物在胁迫条件下能够提高微生物的抗性[22]，冷胁迫和热胁迫之间可能存在交叉保护机制，植物乳杆菌在进行冷胁迫处理后会诱导热胁迫相关基因的表达[23-24]。对菌体进行冷冻干燥后，能抑制菌体的生长代谢，使菌体进入休眠状态，能够更好地应对外界的不良环境[25]。采用微胶囊以及双层包埋的手段可以有效地保护乳酸菌，减少来自外界恶劣环境的影响，延长益生菌活力保持时间[26]。研究发现，采用海藻酸钠[27]、蛋白质[28]、胶体[29-31]和淀粉[32]多糖类等壁材通过喷雾干燥、挤压和乳化的不同方式包埋乳酸菌可以显著提高乳酸菌的热稳定性和贮存期[33]。海藻酸钠对生物无毒性，凝胶机械强度和耐生物分解性良好，是较为合适的固定化细胞载体[34]。通过制粒之后表面喷涂的方式可以有效避免益生菌遭受恶劣的加工环境[35]。此外，不同的贮存温度与贮存方式对乳酸菌的活性保持也有较大的影响[36]。但是，将益生菌包埋和微胶囊技术应用于饲料加工却鲜有报道。

植物乳杆菌CCFM8661是江南大学食品科学与技术国家重点实验室经筛选得到的1株在缓解铅暴露诱导氧化应激和毒性作用[6]的专利菌株。笔者以该菌株作为罗非鱼颗粒饲料添加剂，通过对其以新鲜湿菌体、冻干菌粉和海藻酸钠单层包埋以及制粒后喷涂加工方式，制备成活菌含量为108 CFU/g的益生菌饲料，探究混合、制粒和贮存温度与时间对其活力的影响，旨在为将植物乳杆菌CCFM8661应用于饲料加工探索新的道路。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 试验菌株。试验所用菌株为植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum CCFM8661），由江南大学食品学院生物技术中心实验室自行筛选分离。

1.1.2 培养基。乳酸菌MRS肉汤液体培养基：蛋白胨10 g，牛肉浸膏10 g，酵母浸膏5 g，葡萄糖20 g，乙酸钠5 g，吐温80 1 ml，MgSO4·7H2O 0.1 g，MnSO4·H2O 0.5 g，柠檬酸二铵2 g，K2HPO4 2 g，去离子水1 000 ml，用盐酸调节pH为6.2～6.4。固体培养基加入18～20 g琼脂，于115 ℃下高温灭菌20 min。

1.1.3 饲料原料。饲料原料包括大豆粕、米糠、面粉、鱼粉、棉籽粕、菜籽粕、豆油、预混料（矿物质与维生素）。

1.1.4 主要仪器与设备。AUTOCLAVE MLS3750 型灭菌锅，为三洋电器股份有限公司产品；EL204 型电子天平，为梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司产品；LABCON7948030型冷冻干燥机，为美国Labcon有限公司产品；J6型大容量冷冻离心机，为美国贝克曼公司产品；摇摆式高速粉碎仪，为温岭市林大机械有限公司产品；SKJ120型小型颗粒饲料机，为济南牧龙机械有限公司产品；面包搅拌机，为新麦机械（无锡）有限公司产品；垂直流超净工作台，为上海智诚分析仪器制造有限公司产品；BagMixer400CC型数显拍打式均质仪，为法国Interscience公司产品；GHP9160 型恒温培养箱，为上海一恒科技有限公司产品。

1.2 试验方法

1.2.1 菌种活化与培养。从菌种库中取出菌株接入乳酸菌MRS肉汤液体培养基中进行活化，37 ℃下培养18～24 h，按照2%接种量接种第2代、第3代，以2%接种量扩大培养。

1.2.2 生长曲线的测定。将经2次传代培养18 h至对数期后期的新鲜培养物按0.1%（v/v）接种量接入MRS培养基中，每隔2 h取样，测定培养物在620 nm波长处的OD620 nm值；同时根据需要，对培养物进行10倍系列稀释，并采用标准平板计数法对培养物中的活菌数量进行计数[37]。

1.2.3 饲料制作流程。饲料制作流程如图1所示。

安徽农业科学 2015年

1.2.4 新鲜湿菌体的制备。将菌体活化后，37 ℃条件下扩大培养至稳定期，4 ℃条件下6 000 r/min离心10 min，弃去上清，菌泥用60 mmol/L无菌磷酸盐缓冲液（PBS，pH6.5）洗涤2次后重悬于无菌PBS中（按照PBS/原菌液=1∶100计算），置于4 ℃条件下备用，现用现配。

1.2.5 凍干菌粉的制备。培养与洗涤条件同上，重悬于无菌PBS中（按照PBS/原菌液=1∶10比例计算），再加入同等体积的冻干保护剂海藻糖，使最终浓度为10%。放入平板中覆盖保鲜膜，置于-70 ℃中预冻4 h，将预冻好的菌体，放入Labconco冷冻干燥机中进行冷冻干燥，冷阱温度为-50 ℃，真空度为4 Pa，时间为48 h。冷冻干燥结束后，样品备用置于-20 ℃下备用。

1.2.6 海藻酸钠微胶囊的制备[38-39]。新鲜湿菌体制备之后使用无菌生理盐水重悬调整浓度，以体积比为1∶10与2%海藻酸钠溶液充分混合，并加入0.4%的吐温80，磁力搅拌器搅拌乳化15 min，使用压力喷嘴喷入0.2 mol/L的CaCl2溶液中，固化15 min，用纱布过滤，生理盐水冲洗3次，得到微胶囊。

1.2.7 制粒后喷涂乳酸菌饲料的制备。饲料制粒后，待冷却，将无菌生理盐水稀释的浓缩新鲜菌液用压力喷嘴均匀的喷入颗粒饲料中。

1.2.8 饲料加工对菌株存活的影响。按照一定的添加比例，将益生菌按照不同方式添加到无抗生素、无铜、无锌的罗非鱼饲料中，经过混合机混合得到混合粉状饲料，对粉状饲料中的活菌含量进行检测；将混合后的粉状饲料在制粒机中进行制粒，制粒温度为70 ℃，制粒结束后对颗粒饲料中的活菌含量进行检测。

1.2.9 饲料贮存过程对菌株存活的影响。将不同益生菌添加方式加工的粉状饲料和颗粒饲料分别放于塑料自封袋中，分别存放于4和25 ℃条件下贮存2个月，每隔7 d对颗粒饲料进行1次活菌取样计数。

1.2.10 饲料加工过程的取样方法。在混合机和制粒机出料口抽取样本，每批试验抽取10个样本，每个样品的重量为100 g，考虑进料时间、方位、深度的代表性。每个原始样品充分混匀，采用四分法分取样品。

1.2.11 饲料中活菌数的测定。以新鲜菌泥、冻干菌粉和后喷涂方式制作的饲料称取样品25 g，装入盛有225 ml，0.85%无菌生理盐水的无菌袋中，采用无菌均质仪以8T/s，拍打10 min，充分混匀成样品匀液，取少量液体进行无菌梯度稀释，分别吸取0.2 ml放入装有凝固MRS琼脂培养基的无菌平板中，用无菌涂布棒在培养基表面轻轻涂布均匀，每个样品3个重复，将平板倒置于37 ℃恒温培养箱中培养24～36 h，选取30～300个菌落之间的平板进行计数。以微胶囊方式制作的饲料称取样品25 g加入到无菌的0.06 mol/L的柠檬酸三钠溶液225 ml中，37 ℃振荡处理40 min，随后按上述操作进行计数。

1.2.12 混合前后益生菌存活率的计算。对益生菌饲料进行活菌计数，所得结果乘以饲料重量，记为M。对添加入饲料前的菌液，菌粉和微胶囊进行活菌计数，计算出活菌总数，记为M0。按照以下公式计算混合前后益生菌存活率：

存活率=M/M0×100%（1）

1.2.13 制粒前后益生菌存活率的计算。对制粒前后的饲料进行活菌计数，分别记为W0和W。按照以下公式计算制粒前后益生菌存活率：

存活率=W/W0×100%（2）

2 结果与分析

2.1 CCFM8661的生长曲线

选择菌体在对数生长期末期，稳定期前期进行收菌。从图2可以看出，植物乳杆菌CCFM8661菌体在约18 h后进入稳定期，进入稳定期的活菌数数量级在109。因此，对菌体培养18 h后进行收菌处理。

2.2 混合对不同益生菌添加方式饲料益生菌活性的影响

对混合前后的活菌数进行计数，计算出活菌总数，分别计算存活率为M1、M2、M3（表2）。利用PASW Statistics 18软件进行Oneway Anova分析，利用Tukey进行显著性检验，各组间没有显著差异（P>0.05）。这说明混合单元操作对菌体的活性基本没有影響。

2.3 制粒对不同益生菌添加方式饲料益生菌活性的影响

制粒单元操作对不同添加方式益生菌活性影响较大。由表3可知，对浓缩菌液添加方式和冻干菌粉添加方式的影响较大，其存活率分别降低到了6%和2.54%。采用海藻酸钠进行微胶囊处理后，其存活率显著提升，达到24.01%，相比于另外2个组分别提高了4倍和9倍。这说明海藻酸钠微胶囊能有效的保护益生菌在恶劣加工环境下存活。

2.4 颗粒饲料在4 ℃和25 ℃条件下贮存不同益生菌添加方式颗粒饲料中益生菌活性变化

在不同的贮存温度条件下，益生菌活力变化出现了明显的分化。从图3～4可以看出，4 ℃条件下4组益生菌均表现出良好的稳定性。在1个月时间内4组的益生菌活性均能保持在同一数量级上。从图4可以看出，2个月的贮存试验中，海藻酸钠微胶囊组表现出了最好的稳定性。在第8周时其活菌数仍然能够保持在40%左右。其他3组的活菌数在第6周的时间开始出现较大程度降低，第8周时下降程度最大的是冻干菌粉添加组，其活菌的存活率下降到3.38%。其次为制粒后喷涂益生菌组，为8.16%。造成这种现象的原因可能是海藻酸钠作为微胶囊包裹了乳酸菌，避免了与外界环境的接触，较好地保护了益生菌的存活。冻干菌粉组，虽然菌体在冻干过程中进入了休眠状态，但是可能4 ℃环境并不适合其休眠的环境，导致其在此环境下死亡较多。

从图5～6可以看出，在25 ℃条件下，几乎所有组均表现出不适应性。第5周，均未检测到活菌数。除了海藻酸钠微胶囊组外，其他组在第3周未检测到活菌数。海藻酸钠微胶囊组在前1个月内的活菌数要显著高于其他3个组（P<005）。制粒后喷涂益生菌组也表现出较差的稳定性，第2周以后就检测不到活菌数。

3 讨论与结论

混合所产生的摩擦与热能较小，对微生物及活性物质的危害较小，其对本株植物乳杆菌的影响可以忽略不计，且各组间不存在显著差异。李鑫等研究饲料混合对多种益生菌的影响发现，仅有嗜酸乳杆菌的存活率在95%以下，其他益生菌的存活率都接近100%，都能保持在较高水平[21]。

制粒是颗粒饲料加工过程中对微生物来说最为恶劣的一个单元操作，经过压力摩擦、产热，甚至是蒸汽喷射，最高温度甚至能达到100 ℃，导致蛋白质变性，有益微生物和酶制剂的性能受到严重破坏[20]。该试验中海藻酸钠微胶囊与单独添加益生菌相比显著提高了制粒的益生菌存活率，但仍有一些益生菌死亡，单位益生菌菌液所能制作的合格成品饲料减少，导致生产成本增加。王卫国等[35]报道尽管可以将酶制剂、益生菌制成包膜型或微胶囊型，饲料热加工过程中特别是挤压膨化、挤压膨胀、高温调质、制粒、烘干等加工过程中仍会造成大量损失。笔者尝试避开了制粒的单元操作，使用了制粒后喷涂益生菌的加工方式，在加工成品饲料益生菌上节省了生产成本。

贮存温度是影响益生菌活性及饲料货架期的重要因素[36]，该研究结论也进一步证实了此观点。在4 ℃条件下贮存各个组在各个阶段的饲料益生菌活性均显著高于25 ℃（P<0.05）。在25 ℃条件下贮存制粒后喷涂益生菌的活性下降速度仍然很快，说明只是单纯避开制粒操作而不考虑贮存问题也无法真正解决问题。在较高温度下贮存，对益生菌添加剂进行保护是必要措施，单纯降低贮存温度会大大增加成本。海藻酸钠在乳酸菌包埋中是应用广泛的原料，张强等[27]研究发现，使用海藻酸钠作为包埋剂研究嗜酸链球菌的包埋工艺并分析其生物活性，乳酸菌经过海藻酸微胶囊包埋后其热稳定性和耐贮存稳定性都显著提高，为动物颗粒饲料的制作和运输贮存提供了科学依据。综合分析，解决益生菌在颗粒饲料中的应用需要从多个方面入手，制粒的条件要在保证产品质量的前提下相对的温和，找到最优化的保护益生菌的微胶囊壁材和包埋方式，在制粒和贮存中隔绝益生菌与外界环境，从而达到保护益生菌的目的，进而能够降低生产成本和延长益生菌饲料的货架期。

笔者将植物乳杆菌CCFM8661作为鱼饲料益生菌添加剂，采用新鲜菌液、冻干菌粉和海藻酸钠微胶囊的不同加工工艺，进行加工试验，发现混合对该株益生菌活性影响不大，海藻酸钠微胶囊加工工艺能显著提高益生菌在制粒过程中的存活率。联合制粒后喷涂益生菌组分别在4和25 ℃条件下贮存2个月，发现4 ℃条件下贮存有利于保存益生菌活性，且海藻酸钠微胶囊工艺能在4 ℃条件下保持更稳定的活性，减缓益生菌在25 ℃条件下活力下降速度，保护益生菌的活性。

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