趋化因子受体CCR7下调对95D肺癌细胞侵袭力的影响

刘仁鹏， 陈郭玲， 周 爽， 陶惠红， 杨耀琴

(同济大学医学院肿瘤研究所，上海 200092)



·基础研究·

趋化因子受体CCR7下调对95D肺癌细胞侵袭力的影响

刘仁鹏， 陈郭玲， 周 爽， 陶惠红， 杨耀琴

(同济大学医学院肿瘤研究所，上海 200092)

目的 探讨趋化因子受体CCR7下调对95D肺癌细胞转移、侵袭的影响及相关机制。方法 95D肺癌细胞经不同剂量的白藜芦醇处理后，通过免疫荧光染色、PCR、Western印迹法等观察CCR7及其相关信号通路的表达。Transwell小室检测细胞侵袭和迁移能力。结果 白藜芦醇处理后95D细胞CCR7表达显著降低，与其相关的信号传导蛋白PI3K、p-AKT表达量亦降低，并呈剂量依赖性。Transwell小室结果证明经白藜芦醇处理后的肺癌细胞侵袭力下降，同时也抑制CCR7配体对肺癌细胞的趋化作用。结论 本研究结果提示白藜芦醇下调CCR7的表达同时也可下调PI3K、p-AKT表达，抑制肿瘤细胞侵袭转移的过程并促进其凋亡。

CCR7； 白藜芦醇； 侵袭； 次级淋巴组织趋化因子； 肺肿瘤

肺癌是最常见的恶性肿瘤，病程发展中瘤细胞的转移是引起治疗失败和机体死亡的主要原因之一。组织中的淋巴组织趋化因子(secondary lymphoid tissue chemokine， SLC)能引导表达CCR7的初始T细胞、树状突细胞(dendritic cell, DC)等免疫活性细胞定向迁移并聚集到周围淋巴组织或肿瘤部位，参与免疫抑癌反应，SLC/CCR7被认为与机体免疫微环境的建立有关[1-2]。研究发现CCR7在多种恶性肿瘤组织中，如乳腺癌、肺癌、胃癌、结直肠癌等表达水平升高[3-7]，且与肿瘤细胞的淋巴结转移密切相关。本研究观察天然药物白藜芦醇(resve-ratrol， Res)对肺癌细胞CCR7表达的影响，并对CCR7表达水平变化与肺癌细胞转移和侵袭能力的相关性和机制进行初步探讨。

1 材料与方法

1.1 细胞株及试剂

人肺癌细胞95D购于中科院上海细胞生物研究所；Res购自美国Sigma公司；RPMI、 DMEM液体培养基购自美国Hyclone公司；MTT购自上海碧云天生物研究技术有限公司；CCR7抗体购自美国Ebioscience公司；GAPDH购自武汉博士德公司；SLC(CCL21)购自美国PeproTech公司；胎牛血清购自美国Gibco公司；Transwell购自美国Corning公司；Matrigel胶购自美国BD Biosciences公司；引物设计购自上海生工生物有限公司；PI3K/AKT/p-AKT抗体购自美国Bioworld公司；Prime script 1st strand cDNA、SYBR RPremix Ex TaqTM(Perfect Real Time)购自日本TaKaRa公司；胰酶-EDTA购自上海生工试剂公司；DEPC购自美国Fluka公司；TRIzol试剂购自美国Invitrogen公司。

1.2 荧光定量PCR检测Res处理后CCR7在肺癌细胞中的表达

用TRIzol试剂抽提经80μmol/L Res处理的95D细胞总RNA，以各组细胞cDNA为模板，对细胞中CCR7 mRNA 水平进行Real-Time qPCR 检测。CCR7上游引物为: 5′-AAGCGATG CGATGCTCT-CTC-3′，下游引物为: 5′-TTGCGCTCAAAGTTGC-GTG-3′；actin上游引物为: 5′-GACCTGTACGCC-AACACAG-3′，下游引物为: 5′-CTCAGGAGG AGCAATGATC-3′。PCR反应条件: 95℃ 30s，95℃ 50s，60℃ 20s，72℃ 10s，共40个循环。计算Ct值。采用参照基因的ΔΔCT法计算目的基因的相对表达量。ΔΔCt=(实验组目的基因CCR7平均Ct值-实验组内参actin平均Ct值)-(对照组目的基因CCR7平均Ct值-对照组内参基因actin平均Ct值)。

1.3 荧光免疫细胞化学染色测定CCR7在肺癌细胞中的表达

制备95D细胞爬片，各实验组经Res处理24h，PBS洗涤，100%甲醇固定5～10min，PBS洗涤2遍，按免疫荧光化学反应步骤操作: CCR7一抗1∶250稀释，FITC标记的山羊抗兔二抗稀释度1∶100，各步骤间均用PBS充分浸洗，荧光显微镜下观察。

1.4 Western 印迹法检测Res处理后CCR7、PI3K、AKT、p-AKT表达的变化

使用浓度为0、20、40、80、120μmol/L in Res处理95D细胞24h后，PBS洗涤2遍，每孔加200μl的含有PMSF的蛋白裂解液，冰上裂解10min，4℃，离心半径8cm，12000r/min，离心4min，取上清液，测试蛋白浓度，100℃水浴5min；取上样蛋白10μg，10%浓缩胶[40%丙烯酰胺、双蒸水、1.5mol/L Tris-HCI(pH8.8)、10%SDS、10%APS、TEMED]100V，15min；5%分离胶[40%丙烯酰胺、蒸水、1.5mol/L Tris-HCl(pH6.8)、10%SDS、10%APS、TEMED]70V，45min；采用半干转膜法，根据0.8mA/cm2PVDF膜面积计算设定电流值转膜，转膜结束后用5%脱脂奶粉进行封闭，一抗(GAPDH、CCR7、PI3K、AKT、p-AKT)4℃孵育过夜，次日用辣根标记的二抗孵育，37℃，30min后，行ECL检测。

1.5 Transwell小室测定肺癌细胞的侵袭、迁移能力

95D细胞分组处理24h后，分别接种于标准Transwell小室(测定迁移)和预铺Matrigel胶的Transwell小室(测定侵袭)1×104个/孔，并加入无血清DMEM培养液200μl，下层加入含200ng/ml SLC+2%FBS的DMEM培养液400μl，37℃，24h。取出小室，PBS洗涤2次，100%甲醇固定10min后PBS洗涤2次，结晶紫染色15min，用棉签擦拭小室内层的细胞，倒置显微镜下(×200)随机计数5个视野的穿膜细胞数，计算平均数。

1.6 肺癌动物模型的建立及CCR7、PI3K免疫组织化学检测

取对数生长期的Luciferase-95D细胞制备成细胞悬液，分别于皮下注射1×106个细胞及尾静脉注射 2×106个细胞，制备移植瘤和转移瘤动物模型，待移植瘤直径在0.5cm左右时(或尾静脉接种2周后)，随机分成对照组和Res组，每组6只，分别给予PBS和Res[100mg/(kg·d)-1]腹腔注射，5d为1个疗程，共3个疗程。治疗结束后颈椎脱臼处死小鼠，取瘤组织进行SABC免疫组织化学染色。主要流程如下: 切片脱蜡后经3%H2O2孵育10min，正常血清封闭10min。CCR7、PI3K抗体孵育，4℃过夜。生物素化二抗室温孵育20min后滴加SABC，经DAB显色，苏木精复染后，水洗、封片，显微镜下观察，阳性细胞呈棕色至棕褐。

1.7 统计学处理

实验数据应用SPSS 17.0统计学软件进行统

2 结 果

2.1 Res对肺癌细胞CCR7表达的影响

2.1.1 荧光定量PCR测定结果 结果显示Res处理组细胞CCR7的mRNA相对水平与对照组相比明显降低(对照组与实验组比值为1∶0.19)，差异有统计学意义(P<0.05)，提示Res能够显著抑制CCR7的mRNA转录。

2.1.2 免疫荧光细胞化学染色测定结果 免疫荧光细胞化学染色显示CCR7定位于细胞质和胞膜，经过Res处理24h后，CCR7的表达水平随Res浓度的升高而呈下降趋势，40μmol/L以上作用显著，呈现Res剂量依赖性，见图1。

图1 Res处理后95D细胞CCR7表达水平的变化Fig.1 The expression of CCR7 in 95D cells treated by resveratrolA： 0μmol/L; B： 20μmol/L; C： 40μmol/L; D： 80μmol/L; E： 120μmol/L

2.1.3 Western印迹法测定结果 Western印迹法结果与免疫组织化学染色结果一致，随着Res浓度的增加，CCR7的表达降低，呈剂量依赖性。对照组、Res20、40、80、120μmol/L组的95D细胞CCR相对灰度值分别为1.03±0.08、0.92±0.10、0.85±0.21、0.74±0.05、0.5±0.01。与对照组相比，80、120μmol/L组CCR表达明显降低，差异有统计学意义(P<0.05,P<0.01)，见图2。

2.2 Res对肺癌细胞侵袭及迁移能力的影响

经过不同浓度的药物处理24h后，随着药物浓度的增加，细胞的侵袭能力(穿越Matrigel胶)及迁移能力(无Matrigel胶)逐渐降低，穿膜细胞数显著减少(表1、图3～4)，与对照组比较差异有统计学意义，且各组间也有明显差别(P<0.05，P<0.01)，由此可见，白藜芦醇可以抑制SLC作用下的细胞的侵袭，并呈浓度依赖性。

图2 Res对95D细胞CCR7蛋白表达水平影响Fig.2 Effect of Res on CCR7 in 95D cells detected by Western blotting

2.3 Res对肺癌细胞PI3K、AKT、p-AKT蛋白表达的影响

Western印迹法显示，经不同浓度Res处理后，细胞内Akt表达无显著变化，但PI3K和p-Akt表达均明显降低，并呈现一定剂量依赖性，见图5、表2。

表1 Res处理后穿膜细胞数的变化Tab.1 The number of cells penetrating the membrane after resveratrol treatment ±s)

与对照组相比较，*P<0.05；**P<0.01

图3 Res对95D细胞的侵袭能力的影响Fig.3 The effect of resveratrol on invasion ability of 95D cellsA： 0μmol/L；B： 20μmol/L；C： 40μmol/L；D： 80μmol/L；E： 120μmol/L

图4 Res对95D细胞的迁移能力的影响Fig.4 The effect of Resveratrol on migration ability of 95D cellsA： 0μmol/L；B： 20μmol/L；C： 40μmol/L；D： 80μmol/L；E： 120μmol/L表2 Res对p-Akt、PI3K灰度分析统计结果Tab.2 Image analysis of p-Akt and PI3K expression after treatment with resveratrol

±s)

与对照组相比，*P<0.05;**P<0.01

2.4 动物模型免疫组织化学检测结果

裸鼠移植瘤石蜡切片免疫组织染色镜下观察结果显示，对照组中CCR7分布于细胞质和细胞膜，呈棕黄色或褐色颗粒状强阳性表达；而实验组中，经过药物处理后CCR7的表达降低，与细胞学实验结果相吻合；PI3K主要表达于细胞质和细胞核中，表达水平相对较低,见图6。

图5 Res对95D细胞Akt/p-Akt、PI3K表达的影响Fig.5 Effect of Res on expression of Akt/p-Akt/PI3K in 95D cells detected by Western blotting

图6 Res对肺癌移植瘤CCR7和PI3K表达的影响Fig.6 The effect of resveratrol on expression of CCR7 and PI3K in lung cancer xenografts

3 讨 论

Res作为一种具有抗氧化，抗突变等多种生物学活性的天然醇类，已广泛用于预防心血管疾病、动脉硬化等疾病中[8-9]。有研究表明Res可通过抑制基质金属蛋白酶(MMP)活性、抑制新生血管形成进而发挥抑制肿瘤侵袭、转移的作用[10-12]。

CCR7是机体免疫微环境中一个重要的核心因子，在T细胞、B细胞、NK细胞及重要的抗原呈递细胞表面表达。次级SLC(又称CCL21)是其高亲和力配体[1-3,13]。CCR7与其配体结合后，可以通过其偶联的G蛋白激活多种信号分子将信号传入细胞内，引起一系列细胞生物学反应。SLC/CCR7信号传递主要是通过激发细胞内PI3K和MAPK通路实现的[14]。PI3K是一种胞内磷脂酰肌醇激酶，因其结构和功能的不同分为3类[15]。Akt是PI3K的下游靶点，其通过磷酸化作用激活或抑制下游靶蛋白如Caspase 9、MMPs等，进而调节细胞的增殖、分化、凋亡以及迁移。近年来发现PI3Ks/Akt信号通路参与调节肿瘤细胞的增殖和存活，与肿瘤细胞的迁移、黏附、肿瘤血管生成以及细胞外基质的降解等相关[16-20]，各种癌基因酪氨酸激酶受体，如Ras、Src等均可使其活化[21]，且与肿瘤的发生、发展和预后有密切关系。

有研究提示Res可通过下调CCR7而抑制肿瘤细胞的转移[10]。本研究通过带有Matrigel的Transwell实验进一步证实了Res可通过下调CCR7抑制肿瘤细胞的侵袭。同时，实验结果显示Res能够抑制95D细胞中PI3K/p-AKT表达，且体内实体瘤结果与体外实验吻合，提示Res可能通过抑制CCR7的表达，进而下调PI3K/Akt信号通路的活性，抑制肺癌细胞的侵袭和转移。这为针对PI3K/Akt信号通路关键分子为靶点的肿瘤治疗提供了新的实验依据，其确切机制尚有待进一步探讨。

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Effect of chemokine receptor CCR7 down-regulation on invasion of lung cancer 95D cells

LIURen-peng，CHENGuo-ling，ZHOUShuang，TAOHui-hong，YANGYao-qin

(Cancer Institute, Tongji University School of Medicine, Shanghai 200092, China)

Objective To investigate the effect of down-regulation of CCR7 expression on the invasion and migration ability in lung cancer 95D cells. Methods Human lung cancer 95D cells were treated with different does of resveratrol. The expression of CCR7 and related signaling pathway proteins were assayed by immunofluorescence, Real-Time PCR and Western blotting, respectively. The cell invasion and migration ability were evaluated by Transwell assay. Results The expression of CCR7, PI3K, p-AKT protein in 95D cells were decreased in a dose-dependent manner after resveratrol treatment. Transwell array showed that invasion ability of 95D cells was inhibited with the decreasing of CCR7 expression, and cell migration induced by SLC also inhibited. Conclusion The results suggest that resveratrol can down-regulate expression of CCR7, PI3K and p-AKT, which might be involved in the inhibition of tumor cell invasion and metastasis, and enhance cell apoptosis.

CCR7; resveratrol; invasion; secondary lymphoid tissue chemokine; lung cancer

10.16118/j.1008-0392.2015.04.002

2015-01-01

国家自然科学基金(31000527)

刘仁鹏(1984—)，男，硕士研究生.E-mail: 2012rocpaul@tongji.edu.cn

杨耀琴.E-mail： yaoqiny@163.com

R 734.2

A

1008-0392(2015)04-0007-06