高渗盐水预处理在大鼠缺血再灌注心肌损伤中的保护作用

闻 静， 张敬莹， 仓 彦， 李宪凯， 赵冬冬， 张 戟

(同济大学附属第十人民医院心内科，上海 200072)



·基础研究·

高渗盐水预处理在大鼠缺血再灌注心肌损伤中的保护作用

闻 静， 张敬莹， 仓 彦， 李宪凯， 赵冬冬， 张 戟

(同济大学附属第十人民医院心内科，上海 200072)

目的 研究高渗盐水(hypertonic saline, HTS)预处理对大鼠缺血再灌注心肌的保护作用及相关机制。方法 健康雄性SD大鼠随机分为4组： 假手术组(SO组)、高渗盐水+假手术组 (HTS-SO组)、缺血再灌注组(I/R组)、高渗盐水+缺血再灌注组 (HTS-I/R)，每组10只。大鼠缺血再灌注前经腹腔注射生理盐水或高渗盐水 (4ml/kg,7.5%)进行预处理；建立大鼠心肌缺血再灌注(I/R)模型。检测各组大鼠的心肌梗死范围、心肌酶 (CK、LDH)、炎症介质 (TNF-α、IL-6)、氧化应激指数 (MDA、SOD)等的变化。结果 与对照组比较，高渗盐水显著性抑制大鼠梗死心肌的范围(34.8%±2.0%vs. 51.5%±1.8%)、心肌酶的释放(LDH： 1120.5±90.5vs.1950.5±95.0；CK：1658.8±50.0vs. 2510.5±60.8)、炎症介质的释放( TNF-α： 25.90±0.20vs. 40.20±0.20；IL-6： 35.7±0.20vs. 58.20±0.10)并有效调节氧化应激指数(MD
A： 7.00±0.50vs. 12.00±0.50；SOD： 165.50±5.0vs. 96.50±6.85)(P均< 0.05)。结论 高渗盐水预处理对大鼠心肌缺血再灌注损伤具有保护作用，其保护机制可能与其抑制炎症因子的释放和调节氧化应激有关。

高渗盐水； 缺血再灌注损伤； 炎症； 氧化应激； 大鼠

近年来，缺血再灌注治疗作为急性心肌缺血的有效手段，已在临床上被普遍推广，随之而来的缺血再灌注心肌损伤被证实会明显减弱再灌注的作用[1]。实验证明，缺血再灌注损伤涉及诸多病理生理反应以及信号通路转导，而其中的炎症反应和氧化应激则被证实是缺血再灌注(ischemia-reperfusion， I/R)损伤的主要因素[2]。抗炎和调节氧化应激则可以有效缓解缺血再灌注心肌损伤[3]。

高渗盐水(hypertonic saline, HTS)的抗炎效应逐渐为人们所认识，且大量应用于感染、休克等危重疾病的治疗，并取得了明显成效。研究表明，高渗盐水的使用可以明显减少出血性休克后肺内的中性粒细胞的黏附与聚集，可以显著减少肺水肿和肺组织的炎性损伤，具有强大的抗炎作用[4]。本研究拟通过设计实验来观察和探究高渗盐水预处理是否可以通过抗炎效应而有效发挥对大鼠心肌缺血再灌注损伤的保护作用。

1 材料与方法

1.1 实验动物及分组

成年雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠40只，胎龄 8～ 10周，体质量 250～300g，购于湖南斯莱克景达实验动物有限公司[实验]动物生产许可证号：SCXK(湘)2009-0004]，大鼠采用笼养(5只/笼)，光照12h/d，温度为20～23℃，相对湿度为40%～60%，动物识别采用5%的苦味酸涂抹大鼠背部。

所有动物随机分为4组，每组10只： 假手术组(SO组)、高渗盐水+假手术组(HTS-SO组)、缺血再灌注组(C组)、高渗盐水+缺血再灌注组(HTS-I/R组)。

1.2 缺血再灌注模型的建立

适应性饲养1周后，用戊巴比妥钠(45mg/kg)腹腔麻醉大鼠，后背位固定，气管插管连接动物呼吸机，频率70次/min，潮气0.3～0.4ml/kg，连接心电图，持续记录心电图变化。紧靠胸骨正中于左侧第2～3肋间打开胸腔，暴露心脏，剪开心包膜，于左心耳与肺动脉圆锥之间，用穿有5-0缝合线的3/8弯针钩绕并结扎左冠状动脉前降支(LAD)，以心电图Ⅰ、Ⅱ、aVL导联ST段抬高0.2mV和前壁青紫作为手术成功标志。假手术组仅穿线不结扎。SO组大鼠经阴茎背静脉注射0.9%的生理盐水，仅开胸穿线，不结扎LAD；HTS-SO组大鼠经阴茎背静脉注射7.5%的高渗盐水(4ml/kg)，仅开胸穿线，不结扎LAD；C组大鼠经阴茎背静脉注射生理盐水，行结扎LAD缺血30min，再灌注4h；HTS-I/R组大鼠缺血前，经阴茎背静脉注射高渗盐水(4ml/kg)，行结扎LAD缺血30min，再灌注4h。

1.3 心肌酶的检测

心肌再灌注4h后，各组大鼠均经左心室收集血样3ml置于试管中，4℃,离心半径16cm，12000r/min,离心15min，取上清液-20℃保存。采用全自动生化分析仪测定大鼠血清中的LDH、CK的含量。

1.4 心肌组织中 TNF-α和IL-6的检测

采用ELISA试剂盒(购自南京建成生物研究所)检测心肌组织中 TNF-α、IL-6的含量，操作方法参照说明书。

1.5 心肌组织中MDA和SOD的检测

采用试剂盒(购自南京建成生物研究所)检测心肌组织中MDA和SOD的活性，操作方法参照说明书。

1.6 心肌梗死范围计算

心肌再灌注4h后，每组取5只大鼠处死，迅速切除心脏，按平行于房室沟的方向将心脏切成厚度为 2mm 的薄片，置于 37℃ 的1%TTC溶液内 20min，取出数码照相，利用计算机图像分析软件Image-Pro Plus 3.0计算梗死面积。心肌梗死范围以梗死心肌体积占其左室体积的百分比表示。

1.7 统计学处理

2 结 果

2.1 高渗盐水对大鼠心肌梗死面积的影响

与I/R组比较，高渗盐水显著抑制大鼠心肌梗死面积(34.8%±2.0%vs. 51.5%±1.8%)，差异有统计学意义(P<0.05)。

2.2 高渗盐水对大鼠血清中LDH和CK的影响

与SO组和HTS-SO组比较，I/R组中血清LDH和CK的释放显著升高(P均<0.05)。与I/R组比较，高渗盐水显著抑制血清中LDH和CK的释放(P均<0.05)，见图1。

图1 高渗盐水对大鼠血清中LDH和CK的影响Fig.1 Effects of hypertonic saline on rats serum LDH and CK 与SO组、HTS-SO组相比，*P<0.05；与I/R组相比，▲P<0.05

2.3 高渗盐水对大鼠心肌组织中 TNF-α和IL-6的影响

与SO组和HTS-SO组比较，I/R组中大鼠心肌组织中 TNF-α和IL-6的释放显著升高；与I/R组比较，高渗盐水显著抑制大鼠心肌组织中 TNF-α和IL-6的释放(P均<0.05)，见图2。

图2 高渗盐水对大鼠心肌组织中TNF-α和IL-6的影响Fig.2 Effects of hypertonic saline on TNF-α and IL-6 of myocardial tissue in rats 与SO组、HTS-SO组相比，*P<0.05；与I/R组相比，▲P<0.05

2.4 高渗盐水对大鼠心肌组织中MDA和SOD的影响

如图3A和3B所示，与SO组和HTS-SO组比较，I/R组中大鼠心肌组织中MDA的释放显著增加，SOD的含量显著减少(P均<0.05)。与I/R组比较，高渗盐水可有效抑制大鼠心肌组织中MDA的释放并有效增加SOD的含量(P<0.05)，见图3。

图3 高渗盐水对大鼠心肌组织中MDA和SOD的影响Fig.3 Effects of hypertonic saline on MDA and SOD in rat myocardiumA： MDA；B： SOD 与SO组、HTS-SO组相比，*P<0.05；与I/R组相比，▲P<0.05

3 讨 论

本研究结果显示高渗盐水呈显著性保护大鼠缺血再灌注心肌损伤。此外，本研究进一步证实高渗盐水对大鼠缺血再灌注心肌损伤的保护作用与高渗盐水的抗炎效应以及抑制氧化应激作用相关。

缺血再灌注作为缺血性心脏病确切有效的治疗方法，已被证实可明显诱导心肌组织的炎症反应[5]。研究证明，在IR诱导的炎症反应过程中，中性粒细胞短时间内大量聚集并机械性阻塞毛细血管，导致再灌注效果不佳；此外，中性粒细胞在浸润心肌组织过程中，可释放一系列细胞因子，如 TNF-α和IL-6[6]。据相关报道，在缺血再灌注中，TNF-α对心肌具有负性肌力作用，并能诱导心肌细胞凋亡和坏死，参与心肌损伤，增加心肌梗死面积；而IL-6可直接激活血管内皮细胞及炎症细胞，并通过诱导心肌细胞产生细胞间黏附分子-1(intercellular adhesion molecule-1, ICAM-1)，增强中性粒细胞黏附能力，造成微血管栓塞并最终催化和放大炎症反应[7]。所以，若能最大效应地抑制心肌缺血再灌注过程中炎症因子 (TNF-α，IL-6等)的合成与释放，便可以直接有效减少IR过程中炎症反应所致的心肌损伤。

高渗盐水以其强大的抗炎效应，已经被广泛应用于各种感染、休克等危重疾病。赵建国等[8]通过临床研究发现，应用7.5%的高渗盐水可减少择期腹部大手术后的液体正平衡量，促进液体负平衡提前出现，有明显的抗炎作用。黄湘晖等[9]以家兔气管切开为研究模型，发现应用高渗盐水联合沐舒坦雾化排痰可以有效抑制气道黏膜的高分泌、高水肿的高炎症状态。柯庆宏等[4]研究发现应用高渗盐水预处理可以明显增强缺血再灌注后肝脏 HO-1mRNA、蛋白表达及ET-1含量，降低血清中ALT活性、 TNF-α水平以及肝组织MPO活性，肝脏微循环明显改善，显示高渗盐水可能通过增强肝脏组织中 HO-1的过表达，从而发挥对肝脏缺血再灌注损伤的抗炎作用。此外，George等[10]研究表明高渗环境可显著抑制核因子 -κB的活化，核因子 -κB作为多种炎症过程细胞信号转导的共同途径，其活化受抑将使炎性级联反应受到部分阻遏，同时高渗溶液可以抑制与白细胞黏附有关的多种黏附分子的表达，从而抑制中性粒细胞的黏附，减轻组织炎症与损伤。研究[11]表明，一定的高渗环境可显著提高T淋巴细胞和自然杀伤细胞(NK细胞)的活性，抑制细菌易位和繁殖，增加组织抗感染的能力并减轻组织水肿。

在本实验中，应用高渗盐水在大鼠心肌缺血再灌注前进行预处理，结果显示，与缺血再灌注对照组相比，高渗盐水预处理组中的血清心肌酶、心肌梗死范围以及心肌组织中IL-6和TNF-α的含量均有显著减少，其保护机制可能与高渗盐水抗炎作用有关。此外，本研究还发现，应用高渗盐水还可以有效抑制大鼠缺血再灌注心肌损伤中的氧化应激，其具体作用机制还有待进一步探究。

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Protective effect of hypertonic saline preconditioning on the rat myocardial ischemia and reperfusion injury

WENJing,ZHANGJing-ying,CANGYan,LIXian-kai,ZHAODong-dong,ZHANGJi

(Dept. of Cardiology, Tenth People’s Hospital, Tongji University, Shanghai 200072, China)

Objective To investigate the effect of hypertonic saline(HTS) preconditioning against myocardial ischemia-reperfusion injury(I/R) in rats. Methods Forty healthy male SD rats were randomly divided into four groups： sham operation group(SO); hypertonic saline+sham operation group(HTS-SO); ischemia and reperfusion group(I/R) and hypertonic saline+ischemia and reperfusion group(HTS-I/R). Myocardial I/R was induced by ligation of left anterior descending(LAD) artery and reperfusion for 4h. Hypertonic saline(4ml/kg, 7.5%) was injected in rats of HTS-SO and HTS-I/R groups before ischemia, respectively. The myocardial I/R injury and oxidative stress were assessed. Results Compared to I/R groups, the myocardial infarct size in HYS-I/R group was attenuated(34.8%±2.0%vs. 51.5%±1.8%,P<0.05), myocardial enzymes were reduced(LDH： 1120.5±90.5vs1950.5±95.0; CK： 1658.8±50.0vs. 2510.5±60.8,P<0.05), proinammation cytokines were decreased( TNF-α： 25.90±0.20vs40.20±0.20; IL-6： 35.7±0.20vs58.20±0.10,P<0.05), and oxidative stress was also reduced(MD
A： 7.00±0.50vs12.00±0.50; SOD： 165.50±5.0vs96.50±6.85,P<0.05). Conclusion Hypertonic saline has a protective effect against myocardial I/R injury in rats, which may be related to anti-inflammation and reducing reactive oxygen species(ROS).

hypertonic saline; ischemia-reperfusion injury; inflammation; oxidative stress; rats

10.16118/j.1008-0392.2015.02.005

2014-09-18

国家自然科学基金(30800466)

闻 静(1978—)，女，主治医师，硕士研究生.E-mail： mickey.wen@163.com

张 戟.E-mail： doctorzhangji@163.com

R 541.4

A

1008-0392(2015)02-0020-04