溴化1-甲基-1-苄基-4-(((三苯基锡基)硫)硫代甲酰基)哌嗪-1-铵的活性测定

刘树玲,王保国,方思南

(1.济宁医学院 药学院，山东 日照 276826；2.济宁医学院 生物科学系，山东 日照 276826)



溴化1-甲基-1-苄基-4-(((三苯基锡基)硫)硫代甲酰基)哌嗪-1-铵的活性测定

刘树玲1Δ,王保国1,方思南2

(1.济宁医学院 药学院，山东 日照 276826；2.济宁医学院 生物科学系，山东 日照 276826)

目的 测定硫代甲酸盐有机锡类成盐化合物溴化1-甲基-1-苄基-4 - (((三苯基锡基)硫)硫代甲酰基)哌嗪-1-铵对小鼠的半数致死量(median lethal dose，LD50)、对小鼠体液免疫功能的影响及其抗菌活性。方法 急性毒性试验检测LD50，溶血素测定法测定体液免疫功能，纸片扩散法、倍比稀释法检测其抗菌活性。结果 以小鼠急性死亡率为指标，测得LD50为93.7 mg/kg,可信限为(100.98±8.66)mg/kg，可信限率为8.58%，小于10%，表明实验方法准确度高，数据可靠性高；溶血素测定结果表明：与对照组相比，低、中、高3个剂量组的半数溶血值(half value of hemolysin，HC50)显著较高(P<0.01)，差异有统计学意义，与阴性对照组相比，空白对照组及3个剂量组均较高(P<0.01)，差异有统计学意义，表明此药有提高体液免疫的效果；抗菌活性测定结果表明此药对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌和伤寒杆菌均显示抑菌作用，其中对伤寒杆菌抑制效果最好，其最低抑菌浓度(minimal inhibitory concentration，MIC值)为0.31 mg/mL。结论 溴化1-甲基-1-苄基-4-(((三苯基锡基)硫)硫代甲酰基)哌嗪-1-铵为中度毒性药物，有体液免疫调节作用，且随剂量增加作用降低，对所测菌株具有抗菌活性。

氨基二硫代甲酸盐类化合物；半数致死量；免疫调节；抗菌活性

氨基二硫代甲酸盐或酯类化合物是一类具有抗菌[1]、抗炎[2]、清除体内4-壬基苯酚[3-4]及鳌合重金属[5-6]等作用的化合物，近年来陆续有报道其在抗癌方面的作用[7]。本研究对此结构进行改造，合成了一种新的氨基二硫代甲酸盐类化合物溴化1-甲基-1-苄基-4-(((三苯基锡基)硫)硫代甲酰基)哌嗪-1-铵(1-benzyl-1-methyl-4-(((triphenylstannyl)thio)carbonothioyl)piperazin-1-ium bromide，Tin9)，作为新化合物，其药效学、毒理学等研究还是空白。药物半数致死量(median lethal dose,LD50)是衡量药物毒性大小的指标，评价药物优劣的重要参数，决定其能否在临床应用，本实验测定了LD50；为探究其对免疫功能的影响,用溶血素测定法测定其体液免疫功能；为探究其抗菌活性，以纸片扩散法测量抑菌圈，选取抑菌圈≥10 mm的菌种，用倍比稀释法测量最低抑菌浓度(minimum inhibitory concentration，MIC)，首次报道其活性。

1 材料与方法

1.1 药品与试剂 新化合物Tin9(白色粉末，由济宁医学院药学院王保国老师合成，纯度为96%，结构见图1)；注射用环磷酰胺(Cyclophosphamide, Cys 江苏恒瑞公司，0.2 g/瓶，批号：13120525)；Drabkin试剂(D5941-6VL，Sigma公司)；金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)编号：ATCC6538-1；大肠杆菌(Escherichiacoli)编号：ATCC8089；伤寒杆菌(Salmonellaenterica)编号：ATCC14028由北京微生物保藏中心提供。

1.2 实验动物 100只SPF级KM种小鼠(动物许可证号：2009-0001)，8～12周龄平均体质量(30～40)g，雌雄兼用；2只普通新西兰家兔2～3 kg(动物生产许可证2009-0001)，3.5月龄；4只豚鼠体质量200～300 g(动物许可证号：2009-0001)，3～5周龄；均购自山西医科大学动物中心，给予正常饲料喂养。实验严格遵循《实验动物保护条例》。

1.3 仪器 UV754N紫外可见分光光度计(上海精科实业有限公司)；LD5-2A离心机(北京雷勃尔离心机有限公司)。

1.4 方法

1.4.1 测试溶液的制备：Tin9溶液；用无菌注射用水溶解[加二甲亚砜(DMSO)助溶]按照浓度比为1:4:16:64:128:256配成0.05、0.0125、0.0094、0.0070、0.00312和0.00078 g/mL 6种浓度的溶液作LD50测定用；另配成0.00517、0.00612、0.00703 g/mL(浓度梯度为0.75)，3种浓度用于体液免疫功能测定用。

兔血红细胞溶液：家兔耳缘静脉取血20 mL，后用2000 r/min，离心5 min，弃上清；加与沉淀等量的生理盐水，1500 r/min，离心5 min，清洗2次，弃上清；2000 r/min，离心10 min，弃上清；得兔血红细胞后与生理盐水1:5 稀释；豚鼠血清溶液：豚鼠心脏血10 mL，2000 r/min，离心10 min，取上清，用生理盐水1:10(V:V)稀释，置4 ℃冰箱中备用。

1.4.2 急性毒性试验检测半数致死量(LD50)[8]：预实验 按浓度比为1:4:16:64将药物配成 0.00078、0.00312、0.0125和0.05 g/mL，将24只小鼠分成4组，每组6只，分别腹腔注射药物(2 mL/10 g)，1 h后观察小鼠死亡情况。

LD50测定 根据预实验将36只小鼠分成3组，每组12只，分别腹腔注射0.0125、0.0094、0.0070 g/mL(浓度梯度为0.75)上述配好的该药物(0.2 mL/10g)，1 h后观察小鼠死亡情况。

1.4.3 溶血素测定法测定体液免疫功能[9]：40只KM小鼠随机分低、中、高3个剂量组和空白及阴性对照组，共5组，每组8只，剂量组动物分别皮下注射(2 mL/10 g)0.0125、0.0094、0.0070 g/mL的Tin9，空白对照组给予生理盐水，阴性对照组给予1%环磷酰胺(0.2 mL/10 g)，给药后0.5 h参考文献[10]制备兔红细胞，最适兔红细胞抗原量为20%，每鼠腹腔注射 0.2 mL，免疫小鼠常规喂养6 d后眼球取血，参考文献[9]处理样品，按公式HC50=(吸收度值/兔红细胞溶液半数溶血时的吸收度值)×稀释倍数，计算半数溶血值，所有实验结果重复3次。

1.4.4 纸片扩散法和倍比稀释法[11]检测抑菌活性：受试菌为大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、伤寒杆菌，以DMSO为溶剂，配合物的浓度为10 mg/mL。以纸片扩散法测量抑菌圈，选取抑菌圈≥10 mm的菌种，用倍比稀释法测量MIC，溶剂DMSO为空白对照。

2 结果

2.1 LD50测定结果 预实验结果表明：16倍稀释的注射4只都存活，64倍稀释的注射4只，死亡1只，存活1只，预计此药LD50的浓度在64倍和16倍之间，即在0.0125～0.0032 g/mL范围，继而以0.0125 g/mL为最大浓度，浓度梯度为0.75，配置0.0125、0.0094、0.0070 g/mL浓度溶液，进行LD50测定。

由表1可知，当剂量为93.7 mg/kg，可信限为(100.98 ±8.66)mg/kg，可信限率为8.58%,LD50值为低于500 mg/kg大于50 mg/kg，为中度毒性药物。

表1 Tin9的半数致死量(n=8)

2.2 Tin9对小鼠溶血素含量的影响 由表2可知，空白对照组相比较，低、中、高3个剂量组的HC50值显著较高(P<0.01)，差异有统计学意义；与阴性对照组相比较，空白对照组及3个剂量组的HC50均较高(P<0.01)，差异有统计学意义。

表2 Tin9对小鼠溶血素含量的影响±s)

**P<0.01，与空白对照组比较，compared with blank control group；△△P<0.01，与阴性对照组比较，compared with negative control group

2.3 Tin9抗菌活性测定结果 纸片扩散法和倍比稀释法检测抑菌活性结果见表3。抑菌圈直径越大表明抑菌活性越高。由表3的数据知，该配合物对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、伤寒杆菌均有抑菌效果，其中对伤寒杆菌抑制效果最好，MIC值为0.31 mg/mL。见图1。

表3 Tin9的抗菌活性测定结果

图1 溴化1-甲基-1-苄基-4 -(((三苯基锡基)硫)硫代甲酰基)哌嗪-1-铵的结构Fig.1 The structural formula of 1- methyl -1- benzyl bromide((-4- (three phenyl tin)sulfur)piperazine -1- ammonium thiosulfate formyl)

3 讨论

预实验按LD50实验最大给药量5g/kg配比此药溶液，然后依次配比稀释4、16、64、256、1024倍。这里最大剂量和最小剂量意义不大，所以选用稀释4倍，16倍，64倍，256倍的剂量做预实验。注射后小白鼠颤栗，4 min左右小白鼠开始烦躁不安，继而四肢朝上挣扎，直至死亡。如果4 min后没有此类反应的过一段时间基本恢复正常。低剂量没有死亡，中剂量死亡数量偏少，说明中低剂量浓度可能偏低。3组浓度梯度比为0.75可能过低，建议3组浓度比设为0.8到0.9之间可能会更好。

据本实验分析，溴化1-甲基-1-苄基-4 - (((三苯基锡基)硫)硫代甲酰基)哌嗪-1-铵作为一种新型化合物，LD50值为93.7 mg/kg，低于500 mg/kg大于50 mg/kg，其细胞毒性很强，是中度毒性药物。根据小鼠死前有狂躁，抽搐的表现与有机锡急性中毒症状相似。推测其细胞毒性与其含有的有机锡相关。虽然此药毒性强，但是在剂量较低时，也有增强免疫的效果，可能跟其含有二硫代甲酸盐有关。此类化合物是很好的免疫系统调节剂，但是随剂量增加，其增强免疫效果降低。推测是药物本身的有机锡破坏胸腺细胞导致。抗癌药物是一把双刃剑，在增强机体免疫力的同时会带来毒性问题，所以量是关键。

因HC50值是血清溶血素生成水平，反映机体提高单核吞噬系统功能，即提高抗病能力，随着剂量增大，该值减小，说明此药免疫增强的效果随剂量增加而减小。分析可能是因为二硫代甲酸盐类化合物有调节免疫的效果，使免疫增强，但是有机锡可能影响了胸腺的能量代谢，从而导致胸腺萎缩所致，致使免疫抑制。此药剂量较低时，二硫代甲酸盐类化合物调节免疫的效果强于有机锡的副作用；此药剂量较高时有机锡的毒副作用开始突显，其具体原因还有待研究。另外，相同组的不同个体小鼠的HC50值相差很大，可能是个体差异导致,也可能是测量血清的溶血素的含量及活性的不确定性决定了在进行溶血反应的时候，相同的稀释度的不同血清样品其溶血的反应率可能在比较大的范围内波动[12]，但具体原因还有待进一步研究。

溴化1-甲基-1-苄基-4 - (((三苯基锡基)硫)硫代甲酰基)哌嗪-1-铵对所测金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、伤寒杆菌有抑菌作用，可以提高体液免疫的效果。但是含有有机锡，使此药的毒性较强，如果能找到替代有机锡的其他抗癌金属配合物，降低其毒性，创造出的新药其研究前景将会更加广泛。

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(编校：王冬梅)

Activity determination of 1-benzyl-1-methyl-4-(((triphenylstannyl) thio)carbonothioyl)piperazin-1-ium bromide

LIU Shu-ling1Δ,WANG Bao-guo1,FANG Si-nan2

(1.College of Pharmaceutical, Jining Medical University, Rizhao 276826, China; 2.Department of Biological Sciences,Jining Medical University, Rizhao 276826, China)

ObjectiveTo test median lethal dose(LD50)of the 1-benzyl-1-methyl-4-(((triphenylstannyl)thio)carbonothioyl)piperazin-1-ium bromide on mice, effect on humoral immune function on mice and the antibacterial activity.MethodsBy acute toxicity test for the detection of median lethal dose (LD50),determined the humoral immune function by hemolysin assay method ,and disk diffusion method,double dilution method was used to detect antibacterial activity.ResultsAccording to the acute mortality of mice as index,the LD50for the 1-benzyl-1-methyl-4-(((triphenylstannyl)thio)carbonothioyl)piperazin-1-ium bromide was 93.7 mg/kg,confidence limit was(100.98±8.66)mg/kg,the rate of confidence limit was 8.58% less than 10%,which indicated that the experimental method with high accuracy, and high reliability.humoral immunity determination of HC50value results showed that: compared with control group,HC50value in three dose groups was higher,there was statistical significance(P<0.01),compared with negative control group,HC50value in blank control group and three dose group were higher,there was significant difference(P<0.01),which evidicted the drug could enhance the immunologic effect.Antibacterial activity measurement results showed that the drug forStaphylococcusaureus,EscherichiacoliandSalmonellatyphishowed inhibitory effect,inhibitory effect on Salmonella typhi was the best,the MIC value was 0.31 mg/mL. Conclusion1-benzyl-1-methyl-4-(((triphenylstannyl)thio)carbonothioyl)piperazin-1-ium bromide is a moderately toxic drug,the effect of regulating humoral immunity with the dose increasing,and has antibacterial activity.

dithiocarbamate; LD50; immune regulation; antibacterial activity

济宁医学院校级科研项目(JY2013KJ011)

刘树玲，女，硕士，实验师，研究方向：抗菌药物药理学，E-mail：jyhuangyuan@tom.com。

R965.3；R992

A

1005-1678(2015)01-0034-03