含N—乙酰化肝素寡糖的制备及序列分析

林江慧　张建伟　肖晓毛　高建平　张惠芳　魏峥

摘 要 建立了含N-乙酰化肝素寡糖的分离提纯及其序列结构分析方法。首先应用肝素酶Ⅰ深度酶解低分子量肝素来富集含N-乙酰化结构寡糖，通过Bio-Gel P10凝胶色谱法分离制备了包括二糖至十四糖的系列肝素寡糖粗样品，ProPac PA-1强阴离子高效液相色谱（SAX-HPLC）等方法对粗样品进一步分离，提纯得到4种六糖和3种八糖片段。其次应用肝素酶Ⅰ， Ⅱ和Ⅲ复合酶解与 HPLC法分析各纯化寡糖的二糖组分，并结合肝素酶Ⅰ底物特异性，初步推断4种六糖和3种八糖的序列结构。在寡糖的糖链两端均含有N-硫酸化二糖，而N-乙酰化二糖分布在糖链当中。应用电喷雾离子阱-飞行时间质谱（ESI-IT-TOF-MS）在负离子模式下进一步表征寡糖并分析其裂解规律。结果表明，各寡糖中均出现大量因SO2

3丢失形成的碎片离子峰，六糖中主要有双电荷和三电荷碎片离子峰；在八糖中出现了一系列从双电荷至五电荷的离子峰。各寡糖的双电荷离子峰质荷比进一步确定了上述寡糖的序列结构。六糖的裂解规律表明，裂解主要存在于糖苷键，N-乙酰葡糖胺和糖醛酸上的裂解方式分别为0，2X和0，2Z。本研究提供了切实有效的分离、分析未知结构肝素寡糖序列的新方法。

关键词 肝素寡糖； 飞行时间质谱； 肝素酶； 序列测定

1 引 言

肝素（Heparin， HP）是带有大量负电荷的线性糖胺聚糖，在细胞表面和细胞基质中广泛表达。HP与众多的蛋白质相互作用，调控多种生物学功能。除了抗凝血及抗血拴生成外， 肝素还具有抗平滑肌细胞增殖、抗炎症、抗肿瘤及抗病毒等， 而这些生物活性与肝素的特异结构密切相关【1～3】。

肝素聚糖链由50～200个重复的二糖单元构成。HP二糖是由己糖醛酸（Hexuronic acid， Hex A）与葡萄糖胺（Glucosamine， GlcN）以1-4糖苷键连接而成。己糖醛酸有两种结构，即葡萄糖醛酸或艾杜糖醛酸。己糖醛酸上的修饰有2位氧硫酸化，葡萄糖胺上的修饰有N位硫酸化、 N位乙酰化、C6位氧硫酸化，以及一些稀有结构 C3位硫酸化。这些修饰的组合构成了最常见的8种二糖单元（如表1所示）【4，5】。迄今为止评价HP结构主要是通过分析其酶解二糖组分，对功能性寡糖的序列研究报道不多。

高效液相色谱、凝胶色谱、毛细管电泳、聚丙烯酰胺凝胶电泳等技术已被应用于HP结构的研究【6】。NMR虽然能够测定肝素寡糖结构，但是需要样品纯度高且量较大，这限制了它在微量结构寡糖分析中的应用。由于质谱精度高，可快速分析糖类精细结构。近年来，质谱和液相色谱-质谱联用技术被大量应用于分析HP二糖或寡糖。Kailemia等应用质谱表征了一个类似肝素结构的五糖药物【7】。Huang等通过化学修饰，全序列分析了合成的肝素、硫酸类肝素寡糖类似物【8】。Huang等应用质谱电子转移裂解技术分析了硫酸类肝素寡糖【9】。Shi等应用串联质谱分析了肝素/硫酸类肝素寡糖的SO2

4丢失【10】。Kailemia等应用串联质谱分析了酶化学合成的肝素结构【11】。

肝素大部分结构是高硫结构，N-乙酰化结构含量较低，但这部分结构对于肝素功能也是至关重要的【11】。肝素六糖和八糖通过特殊的序列与多种蛋白质、酶等相互作用调控肝素的生理功能。肝素的抗凝血和抗带状疱疹病毒作用的六糖片段中C3位硫酸化和N位乙酰化部位是活性的必需位点【12】。肝素的N位基团是它与多种细胞增长因子相互结合的必要位点【13，14】，并且具有抑制肿瘤细胞来源的类肝素酶的活性【15】。最引人关注的是，低分子量肝素在临床上有直接的抗癌活性，它有助于延长肿瘤患者的生存时间，推测这与肝素的微量结构有着密切关系【16，17】。

分析微量结构肝素寡糖的序列，不仅对其结构与功能的研究具有重要意义，同时也为肝素作为有效的抑制剂提供了理论基础。肝素酶是制备二糖和寡糖的重要工具酶。其中肝素酶I对含有N位和C2位SO2

4的高硫二糖具有底物特异性【6】，对含N-乙酰化低硫结构不酶解。

本研究基于肝素酶Ⅰ底物特异性，采用二糖组分分析法，酶解低分子量肝素，分离制备含N-乙酰化肝素寡糖，初步确定了它们的序列结构，并通过质谱测定寡糖的质荷比及裂解规律。与文献报道中用质谱表征合成的已知结构的肝素寡糖类似物相比，本研究采用天然肝素对其寡糖的研究更具现实意义。

2 实验部分

2.1 仪器与试剂

1200系列高效液相色谱仪（HPLC，美国Agilent公司）；Christ Alpha 1-4 LD Plus冷冻干燥机、Christ RVC 2-18真空离心浓缩仪（德国Christ公司）； MS-IT-TOF离子阱飞行时间质谱、2450型紫外分光光度计 （日本岛津公司）。ProPac PA-1强阴离子交换（SAX）色谱柱（250 mm×4.0 mm，美国Dionex公司）；Bio-Gel P10凝胶色谱柱 （115 cm × 1.7 cm，fine grade，美国Bio-Rad公司）。

低分子量肝素（分子量1000～14000 Da，英国Leo Laboratories公司）；8种肝素标准二糖（ΔHexA（2S）-GlcNAc，ΔHexA-GlcNAc，ΔHexA-GlcNAc（6S），ΔHexA（2S）-GlcNS，ΔHexA-GlcNS，ΔHexA-GlcNS（6S），ΔHexA（2S）-GlcNAc（6S），ΔHexA（2S）-GlcNS（6S）），四糖（dp4），六糖（dp6），八糖（dp8），十糖（dp10），十二糖（dp12）， 十四糖（dp14） （英国Idroun公司）；肝素酶Ⅰ，肝素酶Ⅱ， 肝素酶 Ⅲ（美国Sigma公司）；乙腈（色谱纯，德国Merck KGaA 公司）；乙酸铵，碳酸氢铵（分析纯，美国Sigma公司）；NaCl（色谱纯，美国Sigma公司）；BSA（生物级，美国MPBio公司）；其它试剂为国产分析纯。endprint

2.2 低分子量肝素深度酶解

200 mg低分子量肝素溶解在2 mL 0.1 mol/L乙酸钠缓冲溶液（含0.1 mmol/L乙酸钙和100 μg/mL BSA， pH 7.0）中，加入50 mIU肝素酶Ⅰ在37 ℃酶解12 h后，加入50 mIU肝素酶Ⅰ继续酶解12 h。加热至沸3 min终止反应。10000 r/min离心10 min，取上清液，冻干。

2.3 肝素寡糖的粗分离制备

上述样品用1 mL 0.2 mol/L NH4HCO3溶解，上样到Bio-Gel P10凝胶色谱层析柱（115 cm×1.7 cm）。0.2 mol/L NH4HCO3洗脱，流速0.2 mL/min。紫外检测波长232 nm，依次收集每个色谱峰对应的糖片段。55 ℃加热24 h 挥发NH4HCO3，冻干获得肝素寡糖粗样品。

2.4 肝素寡糖的细分与制备

ProPac PA-1柱强阴离子交换HPLC（250 mm×4.0 mm）进一步分离2.3节中获得的dp6和dp8寡糖。流动相A 为超纯水（以 HCl调至pH 3.5），流动相B 为， 2 mol/l NaCl（以 HCl调至pH 3.5）。dp6和dp8粗样品溶解在1 mL水（pH 3.5）中，上样。流速1 mL/min，线性梯度洗脱：0～2 min， 100% A； 2.1～7.1 min， 100%～60% A； 7.1～47.1 min， 60%～25% A。检测波长232 nm。收集色谱峰对应的寡糖样品，截留分子量500透析膜（美国Spectrum公司）透析2天，冻干，得到 dp6a， dp6b， dp6c， dp6d， dp8a， dp8b和dp8c 纯品。

2.5 肝素寡糖组分分析

2.5.1 各粗样组分分析 取2.3节制备的四糖（dp4）、六糖（dp6）、八糖（dp8）、十糖（dp10）、十二糖（dp12）、十四糖（dp14）、大于十四糖（>dp14）各50 μg，分别加入10 mIU肝素酶Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ完全酶解，SAX HPLC分离。色谱条件如下：A 为超纯水（以 HCl调至pH 3.5），流动相B 为 2 mol/L NaCl（以HCl调至pH 3.5）。样品溶解于1 mL A中。色谱流速1 mL/min，线性梯度洗脱：0～2 min， 100% A；2.1～35.1 min，100%～75% A；35.1～57.1 min，75%～50% A。232 nm紫外检测。

2.5.2 寡糖dp6a， dp6b， dp6c， dp6d， dp8a， dp8b和dp8c 纯样品组分分析

取2.4节制备的dp6a ， dp6b， dp6c， dp6d， dp8a ， dp8b和dp8c各100 μg， 分别加入5 mIU的肝素酶Ⅰ， Ⅱ， Ⅲ完全酶解，SAX HPLC分离，色谱分离条件同上。

2.6 肝素寡糖质谱分析

离子化模式：ESI源；负离子模式；雾化气（高纯N2）流速1.50 L/min；干燥气（高纯N2）流速10 L/min；加热模块温度200 ℃；曲形脱溶剂管（CDL）

温度200 ℃；离子源电压4.5 kV；检测器电压1.6 kV；质量扫描范围：m/z 200～2000。准确吸取10 μL 50 μg/mL的dp6a， dp6b， dp6c， dp6d， dp8a， dp8b， dp8c，在负离子模式下，手动注入质谱仪。

图1 凝胶色谱柱分离肝素寡糖的色谱图

Fig.1 Separation of heparin oligosaccharides on

Bio-Gel P10 chromatographic column

洗脱液： 0.2 mol/L NH4HCO3，流速： 0.2 mL/min，紫外检测波长： 232 nm。

Elution： 0.2 mol/L NH4HCO3， flow rate： 0.2 mL/min， UV detection wavelength： 232 nm.

3 结果与讨论

3.1 肝素寡糖的粗分离及组分分析

如图1所示，肝素寡糖混合样品经Bio-Gel P10 凝胶层析柱，依据分子量大小分离，获得肝素二糖及一系列寡糖。通过与寡糖标样的洗脱时间对照（外标法）可知，图1中各峰对应二糖（dp2）、四糖（dp4）、六糖（dp6）、八糖（dp8）、十糖（dp10）、十二糖（dp12）、十四糖（dp14）以及 大于十四糖（>dp14）。从图1可见，Bio-GelP10凝胶色谱柱能够完全分离7种肝素寡糖和二糖，其中dp2的含量最高，随着寡糖分子量的增加，含量逐渐减少。由于肝素酶I对含有3个SO2

4的高硫二糖具有底物特异性【6】，不能酶解含N-乙酰化低硫二糖，因此推断以上系列寡糖中含有不同长度的N-乙酰化二糖结构。

2.3节中制备的寡糖dp4至>dp14按2.5.1节方法经肝素酶酶解-SAXHPLC分离，得到其二糖组分见表2，dp4至>dp14 的寡糖中均含有4种N-乙酰化二糖（dp4除外），4种N-硫酸化二糖。ΔHexA-GlcNAc随着寡糖分子量的增加，含量呈递增趋势。同样，ΔHexA-GlcNAc（6S） 和ΔHexA（2S）-GlcNAc的含量也呈现递增趋势。ΔHexA（2S）-GlcNAc（6S）含量变化不太。dp6至>dp14 的系列寡糖中，含N-乙酰化总二糖含量明显递增。上述结果表明，随着寡糖分子量的增加，N-乙酰化二糖增加的可能个数为1～3个。

N-硫酸化二糖含量变动趋势与N-乙酰化二糖不同。从dp6至>dp14 的寡糖中ΔHexA-GlcNS含量呈明显递增趋势，变动范围为1.9%→16.5%。ΔHexA-GlcNS（6S）呈递减趋势（20.8%→9.8%）。ΔHexA（2S）-GlcNS和ΔHexA（2S）-GlcNAc（6S）的含量变化不大，仅有3.0%和2.0%左右的波动。从表2可见，以>dp14为例，N-硫酸化二糖（NS-dp2）占总二糖含量为59.5%，2-O硫酸化二糖占43.5%，6-O硫酸化二糖（6S-dp2）占49.0%。寡糖系列中，随着分子量的增大，NS-dp2百分含量（84.3%→59.5%），2S-dp2百分含量（84%→43.5%）和 6S-dp2百分含量（87.0%→49.0%）都呈现降低的趋势。endprint

3.2 dp6，dp8分离提纯及序列分析

利用SAX-HPLC进一步分离dp6和dp8寡糖（见图2）， dp6主要含有4个寡糖为dp6a， dp6b， dp6c， dp6d和dp8主要有3个寡糖dp8a， dp8b和dp8c。各提纯组分经肝素酶Ⅰ， Ⅱ和Ⅲ完全酶解后，SAX-HPLC分析，外标法鉴定其二糖组成及摩尔比（表2）。

表3列出了按2.5.2节中分析dp6和dp8 细分寡糖的组分及摩尔比。dp6a含有两种二糖结构ΔHexA-GlcNS， ΔHexA2S-GlcNS6S，摩尔比接近2∶1。基于肝素酶Ⅰ底物特异性，二糖GlcA2S-GlcNS6S在寡糖结构的末端。因此，dp6a序列结构为ΔHexA-GlcNS-HexA-GlcNS-HexA2S-GlcNS6S。按同理分析为了解质谱在测试寡糖中的精确度，表4列出了双电荷理论质荷比、实测质荷比及偏差。偏差范围在

34.1～37.4 ppm 之间。肝素寡糖质谱相对较复杂，质谱数据中还能观测到一系列的同位素峰。

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