猪流感病毒免疫应答反应的研究进展

田　亮　穆　秦　岳　登　付塞琴

（陕西省铜川市动物卫生监督所，陕西铜川727031）

猪病防控Swine Disease Prevention and Control

猪流感病毒免疫应答反应的研究进展

田亮穆秦岳登付塞琴

（陕西省铜川市动物卫生监督所，陕西铜川727031）

摘要：猪流感是由猪流感病毒引起的一种呼吸道传染病，从目前的研究结果看，其免疫应答机制并不十分清楚。本文从流感病毒在体外、体内与猪免疫系统之间的相互作用两方面就猪流感的免疫应答反应做一综述，以期为更好地防治猪流感提供参考。

关键词：猪流感；免疫应答；综述

近年来，关于流感疾病的研究有了很大进步。然而，流感病毒疾病仍然是给人类健康造成威胁的主要疾病之一，并且多种动物均可感染。该病毒是有外壳的正粘病毒科的单链RNA病毒，主要分为A、B、C型。A型流感病毒是以血凝素（HA）和神经氨酶（NA）为依据的亚种，目前有17个HA型和9个NA型[1]。A、B型流感病毒RNA分别由8个节段基因组成，编码11或者12个代表性病毒蛋白[2]。猪流感病毒是引起猪呼吸道症状的重要疾病，主要由H1N1、H1N2和H3N2三个亚型引起。猪对人和禽流感病毒易感，由于人流感病毒、禽流感病毒、猪流感病毒三者或者两两之间会发生基因重组，因此猪可能是流感病毒产生新变异的“混合器”[3]。猪感染后可能进一步导致病毒变异，将其传播给人类。

大量的研究表明，甲型H1N1流感病毒和其他型的流感病毒在感染猪的发病机理和传播途径方面有了进一步的研究。流感病毒对猪和人的致病机理及组织嗜性具有相似性，因此，在研究不同流行性感冒传染病方面，猪是一个理想的实验动物[4]。

在体外，流感病毒能够感染多种细胞，包括MDCK细胞系、VERO细胞系、人血单核细胞及人单核巨噬细胞；在体内，流感病毒主要感染动物和人的呼吸道上皮细胞。近年来，对病毒的黏附与发病机制研究较多，但对流感病毒与细胞相互作用的免疫应答反应研究较少。因此，本文主要针对猪对猪流感病毒的免疫应答反应做一综述。

1体外流感病毒与猪免疫系统之间的相互作用

1.1上皮细胞

上皮细胞是宿主的第一道防御屏障和流感病毒攻击的主要目标，因此研究流感病毒与呼吸道上皮细胞之间的相互作用，对流感病毒的防控具有重要意义。Nunes 等[5]以猪气管作为体外的器官培养基，表现出与体内病毒感染类似的组织病变。Punyadarsaniya等[6]用精密肺切片培养基与猪呼吸道上皮细胞培养基培养猪流感病毒和低致病性禽流感病毒进行比较，发现禽流感病毒H9N2型比H7N7型更易感，并且猪流感病毒比禽流感病毒生长更快，三种病毒在感染48小时后仍具有纤毛运动，并且随着感染中病毒数量的增加，纤毛运动停止。结果表明，这三种病毒均能够感染纤毛上皮细胞，猪流感病毒也能感染黏液细胞。

Bateman等[7]用H3N2型和人源重组基因的猪流感病毒感染呼吸道上皮细胞，其能够在富含维甲酸和表皮生长因子的培养基的气液界面生长，甚至在缺少外源性胰蛋白酶的情况下也能生长。Sun等[8]证明，人型、猪型以及禽型流感病毒在猪肠上皮细胞系上易感，但人的B型流感病毒生长不佳。因此，可以将猪肠上皮细胞系作为猪流感病毒培养基，研究流感病毒在呼吸系统的发病机理。

1.2天然免疫系统

天然免疫系统是抵抗流感病毒感染的第二道防线，由黏液、凝集素和急性时相蛋白等组成，防止呼吸道上皮细胞受到感染。

1.2.1胶原凝集素表面活性蛋白D（SP-D）

SP-D属于C型凝集素家族，是天然免疫系统的重要效应器。Hillaire等[9]研究表明，猪SP-D能够结合血凝素，抑制神经氨酸酶的活性比人源重组SP-D蛋白的效果更好，预测SP-D能够作为抗过滤性病原体介质来抵抗体外流感病毒。SP-D蛋白对A型流感病毒的抵抗范围更广，且能够中和多种H1N1和H3N2流感病毒，SP-D能够阻止人流感病毒H1N1和H3N2黏附呼吸道上皮细胞的感受器。

1.2.2巨噬细胞

Seo等[10]报道，人源流感病毒产生α干扰素（α-IFN）的量远高于H1N1型和B型流感病毒。α干扰素蛋白随着感染时间的增加而增加，肺泡巨噬细胞在感染流感病毒时不凋亡，表明肺泡巨噬细胞在流感病毒的感染机理和免疫应答反应中具有重要作用。

Kim等[11]研究表明α-IFN可能在猪流感病毒感染的病理生理学中具有重要的调节作用。有研究证实，用实时定量RT-PCR检测被H1N1感染的猪巨噬细胞的细胞因子，感染后16小时IL-6和IL-8水平在上调，并且感染后36小时IL-8水平继续升高，可能由于细胞死亡，诱导产生大量的抗病毒的α-IFN和肿瘤坏死因子。由于在感染前可能存在大量的肿瘤坏死因子相关的凋亡诱导配体，因此不能检出残留的FasL和α肿瘤坏死因子[12]。

1.2.3树突状细胞

常见的树突状细胞(cDCs)，位于呼吸道上皮屏障下方和基底膜上方，通过被呼吸道上皮细胞紧密连接扩展的树突监测呼吸道的内腔[13]。cDCs能检查和调理病毒粒子。在流感病毒感染时产生的多种树突状细胞中，许多具有细胞溶解活性，并且能够促使支气管相关的淋巴组织(BALT)产生[14]。有研究表明，猪骨髓树突状细胞构成了类似于流感病毒体内感染的小囊泡，并且在细胞质中释放。在表面感染8小时后才能检测出有限的病毒，然而，当产生细胞与细胞间相互作用时，病毒粒子从受感染的猪骨髓树突状细胞中诱导易感细胞，产生细胞致病作用[15]。

类浆树突状细胞(pDCs)是树突状细胞的一个亚型，猪的pDCs在对所有分离株应答时都能够产生高水平的α-IFN，且α-IFN分泌具有很高的专一性，通过研究表明在pDCs应答反应中必须保持HA和它结合功能的完整性[16]。

1.2.4自然杀伤细胞

自然杀伤性细胞是天然免疫应答反应重要的效应细胞。它们能够识别抗体结合的流感病毒感染的细胞，并裂解这些细胞，这一过程称为抗体依赖细胞的细胞毒性作用(ADCC)。有研究预测，恒量的自然杀伤性T细胞（iNKT）能够刺激产生细胞免疫功能并调节感染引起的病理改变[17]。猪的自然杀伤性细胞单克隆抗体和猪肺中检测到的iNKT细胞，在猪体内具有识别自然杀伤性细胞的标记，表明这些细胞对于流感病毒感染猪具有重要作用[18]。

2猪感染流感病毒的体内免疫应答

流感病毒引起的疾病在猪和人上的症状基本类似，具有较低的死亡率但较高的发病率[19]。猪易感禽源和人源的流感病毒，并且偶然传播给人类。因此，研究其在体内的免疫应答反应具有重要意义。

2.1急性时相蛋白

急性期反应是各种刺激引起有机体的非特异性的早期反应。促炎细胞因子调节这些反应，包括局部和全身反应，引起急性时相蛋白(APPs)浓度的变化[20]。猪的APPs有C反应蛋白(CRP)、结合珠蛋白(Hp)、血清淀粉样蛋白A(SAA)和猪主要急性时相蛋白(Pig-MAP)，然而仅有少量研究探讨了APPs在流感病毒感染期的作用。

Brookes等[21]研究表明，H1N1流感病毒在急性感染期时，CRP和Hp的浓度增加。有报道称，猪流感病毒H1N1通过气管感染猪，CRP、Hp、LPS结合蛋白（LBP）存在于支气管肺泡灌洗液（BALF）中，CRP和Hp在感染2天后、LBP在感染30天后达到最高值，之后减少。然而在血清中，CRP和Hp浓度在48小时达到最高值，而LBP水平基本维持稳定。APPs在血清中的水平高于在BALF中，并且和病毒载量没有直接关系。有少量猪在控制感染病毒浓度后其APPs浓度没有显著的变化[22]。

当大量的病毒被释放时，被感染猪的CRP、Hp、SAA浓度显著增加，并且Pig-MAP的水平保持不变，且血清中SAA的浓度与肺功能正相关，提示SAA可以作为试验感染的指示或者作为疾病严重程度的标志[23]。

2.2猪流感病毒

2.2.1母源抗体作用

Loeffen等[24]用猪流感病毒H1N1进行同源感染，表明母源抗体保护猪抵抗临床感染初期的流感病毒，但这些保护并不完全。Kitikoon等[25]研究表明，母源抗体抑制血清中的抗体反应，用二价的灭活疫苗免疫后能诱导产生猪流感病毒的特异性记忆T细胞。有母源抗体的猪免疫后，用异源的H1N1病毒攻击时，可观察到肺炎症状明显。

2.2.2 H1N1和H3N2流感病毒

接种猪流感病毒H1N1的猪体内，检测到具有生物活性的α-IFN、α-TNF和IL-1，细胞因子在发病初期广泛存在，并且伴有呼吸道症状甚至引起支气管坏死。研究显示，α-IFN、α-TNF和IL-6与肺中病毒量和症状的严重程度有关，表明其与猪流感病毒发病机理有关[26]。

Larsen等[27]研究表明，猪在感染猪流感病毒H1N1期间产生全身的黏膜应答反应，IgG在血清中占优势，IgA在上下呼吸道中占优势。IFN-α分泌细胞作为T细胞应答反应的标志，主要集中在脾脏和器官支气管淋巴结。

Kim等研究了感染猪流感病毒H1N1和H3N2的猪的抗体对特异性病毒蛋白的应答反应，NP蛋白的血清学检测不受亚型的限制，NS1的血清学检测在感染和疫苗接种猪具有差异。Heinen等研究表明，感染后4～7天出现特异性IgM且病毒在口咽中被清除。因此，认为初次感染后IgM与病毒的清除有关。Kitikoon等研究表明，不同型的猪流感病毒在感染初期，M2抗体应答反应较低，受到同源病毒的攻击时抗体滴度不增加，但是受到异源病毒的攻击时抗体滴度增加。当发生血清转化时，HA、M2e对感染的剂量产生影响，而M1不影响抗体水平。

2.2.3 H1N2流感病毒

Jo等在感染H1N2猪流感病毒的猪肺中检测到高剂量的IL-1、IL-8和α-TNF，感染后5天α-TNF的量达到最高值，感染3天后鼻液中分泌病毒。Kim等将猪流感病毒经鼻腔接种3周龄的猪，能够在BAL中产生相同的细胞因子，感染后1天BAL中的α-TNF浓度达到最高值，感染3天后显著下降，在BAL中α-TNF的水平与体温相关并且肺的损伤与α-TNF的浓度正相关。

猪流感病毒H1N2感染5天后能够检测到特异性T细胞，感染7天后在猪血清中能够检测到抗体。猪流感病毒H1N2感染的免疫应答反应比其他亚型H1N1和H3N2的应答反应迟缓。

3展望

尽管猪流感所致的死亡率不高，与其他病毒性猪传染病相比，造成的经济损失也小得多，但由于猪是人流感和禽流感的“混合器”，又由于猪可以作为人流感病毒的存储器，在猪体内保持很长时间，在适当的条件下，这些病毒可在人群中造成流行，因此猪流感具有重要的公共卫生意义。因此，开展对猪流感免疫应答反应的研究，不仅对猪流感病的防治具有重要意义，而且对禽、人流感的研究具有参考价值。

主要参考文献

[1] Tong S, Li Y, Rivailler P, et al. A distinct lineage of influenza A virus from bats [J]. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 2012, 109:4269-4274.

[2] Medina R, Garcia-Sastre A. Influenza A viruses: new research developments[J]. Nature Reviews Microbiology, 2011(9):590-603.

[3] Ma W, Lager K, Vincent A, et al. The role of swine in the generation of novel influenza viruses [J]. Zoonoses Public Health, 2009, 56: 326-337.

[4] Meurens F, Summerfield A, Nauwynck H, et al. The pig: a model for human infectious diseases[J]. Trends in Microbiology, 2012, 20:50-57.

[5] Nunes S, Murcia P, Tiley L, et al. An ex vivo swine tracheal organ culture for the study of influenza infection [J]. Influenza and Other Respiratory Viruses, 2010(4):7-15.

[6] Punyadarsaniya D, Liang C, Winter C, et al. Infection of differentiated porcine airway epithelial cells by influenza virus: differential susceptibility to infection by porcine and avian viruses [J]. PLoS ONE, 2011, 6:e28429.

[7] Bateman A, Karasin A, Olsen C. Differentiated swine airway epithelial cell cultures for the investigation of influenza A virus infection and replication. Influenza and Other Respiratory Viruses, 2013, 7(2): 139-150.

[8] Sun Z, Huber V, McCormick K, et al. Characterization of a porcine intestinal epithelial cell line for influenza virus production[J]. Journal of General Virology, 2012, 93:2008-2016.

[9] Hillaire M, Van E, Van T, et al. Assessment of the antiviral properties of recombinant porcine SP -D against various influenza A viruses in vitro[J]. PLoS ONE, 2011, 6:e25005.

[10] Seo S, Webby R, Webster R. No apoptotic deaths and different levels of inductions of Infla-mmatory cytokines in alveolar macrophages infected with influenza viruses[J]. Virology, 2004, 329:270-279.

[11] Kim B, Ahn K, Ha Y, et al. Association of tumor necrosis factoralpha with fever and pulmonary lesion score in pigs experimentally infected with swine influenza virus subtype H1N2[J]. Journal of Veterinary Medical Science, 2009, 71:611-616.

[12] Gao W, Sun W, Qu B, et al. Distinct regulation of host responses by ERK and JNK MAP kinases in swine macrophages infected with pandemic (H1N1) 2009 influenza virus [J]. PLoS ONE, 2012,7: e30328.

[13] Kreijtz J, Fouchier R, Rimmelzwaan G. Immune responses to influenza virus infection[J].Virus Research, 2011, 162:19-30.

[14] Kreijtz J, Fouchier R, Rimmelzwaan G. Immune responses to influenza virus infection[J]. Virus Research, 2011, 162:19-30.

[15] Mussá T, Rodriguez-Carino C, Pujol M, et al. Interaction of porcine conventional dendritic cells with swine influenza virus[J]. Virology, 2011, 420:125-134.

[16] Calzada-Nova G, Schnitzlein W, Husmann R, et al. Characteri-zation of the cytokine and maturation responses of pure populations of porcine plasmacytoid dendritic cells to porcine viruses and toll-like receptor agonists [J]. Veterinary Immunology and Immunopathology, 2009, 135:20-33.

[17] Paget C, Ivanov S, Fontaine J, et al. Potential role of invariant NKT cells in the control of pulmonary inflammation and CD8+ T cell response during acute influenza A virus H3N2 pneumonia [J]. Journal of Immunology, 2011, 186:5590-5602.

[18] Mair K, Essler S, Patzl M, et al. NKp46 expression discriminates porcine NK cells with different functional properties [J]. European Journal of Immunology, 2012, 42:1261-1271.

[19] Brown I. The epidemiology and evolution of influenza viruses in pigs[J]. Veterinary Microbiology, 2000, 74:29-46.

[20] Pomorska M, Markowska D, Pejsak Z. Acute phase protein response during subclin-ical infection of pigs with H1N1 swine influenza virus[J]. Veterinary Microbiology, 2012, 159:499-503.

[21] Brookes S, Nunez A, Choudhury B, et al. Replication,pathogenesis and transmission of pand-emic (H1N1) 2009 virus in non-immune pigs[J]. PLoS ONE, 2010, 5:e9068.

[22] Barbe F, Atanasova K, Van R. Cytokines and acute phase proteins associated with acute swine influenza infection in pigs [J]. Veterinary Journal, 2011, 187:48-53.

[23] Pomorska M, Markowska D, Kwit K. Immune and acute phase response in pigs experimentally infected with H1N2 swine influenza virus [J]. FEMS Immunology and Medical Microbiology, 2012, 66:334-342.

[24] Loeffen W, Heinen P, Bianchi A, et al. Effect of maternally derived antibodies on the clinical signs and immune response in pigs after primary and secondary infection with an influenza H1N1 virus[J]. Veterinary Immunology and Immunopathology, 2003, 92:23-35.

[25] Kitikoon P, Nilubol D, Erickson B, et al. The immune response and maternal antibody interference to a heterologous H1N1 swine influenza virus infection following vaccination[J]. Veterinary Immunology and Immunopathology, 2006, 112:117-128.

[26] Van R, Van G, Pensaert M. Correlations between lung proinflammatory cytokine levels,virus replication, and disease after swine influenza virus challenge of vaccination-immune pigs[J]. Viral Immunology, 2002, 15:583-594.

[27] Larsen D, Karasin A, Zuckermann F, et al. Systemic and mucosal immune responses to H1N1 influenza virus infection in pigs[J]. Veterinary Microbiology, 2000, 74:117-131.

中图分类号：S855.3

文献标识码：A

文章编号：1673-4645(2015)01-0045-04

收稿日期：2014-08-27