基于UPLC-QTOF-MS/MS对2型糖尿病中医证型的代谢组学研究

陈爱娟，吴 芳，陈 伟

（苏州市中医医院，江苏215009）

基于UPLC-QTOF-MS/MS对2型糖尿病中医证型的代谢组学研究

陈爱娟，吴 芳，陈 伟

（苏州市中医医院，江苏215009）

目的将传统中医辨证方法与现代系统生物学理论相结合，研究2型糖尿病中医辨证分型及虚实证与基于超高效液相色谱法（UPLC）-四极杆飞行时间（QTOF）-质谱（MS）/MS的血清代谢组学的关系。方法选择2013年6月至2014年4月住院并确诊为2型糖尿病患者90例（辨证分为阴虚热盛、气阴两虚、血淤气滞3种证型）。应用UPLCQTOF-MS/MS方法测定健康者及不同中医证型2型糖尿病患者血清内源性代谢物，并用偏最小二乘-判别式分析（PLS-DA）代谢谱。结果PLS-DA分析结果表明，该法不仅可有效区分疾病组和健康对照组，也可明显区分患者中阴虚热盛、气阴两虚、血淤气滞3种证型。结论基于UPLC-QTOF-MS/MS和模式识别的代谢组学技术在揭示传统中医理论本质及对2型糖尿病的临床研究方面具有广泛的应用前景。

代谢；糖尿病，2型；中医学；辨证分型；超高效液相色谱-四极杆飞行时间-质谱

2型糖尿病是一种全球性的常见、多发慢性疾病，严重威胁人类健康。发病率和死亡率紧随癌症，心、脑血管病之后[1]。近年来，针对糖尿病发病机制展开了广泛研究，形成了脂毒说和炎症说2种观点。然而针对这2种观点尚缺乏治疗糖尿病的有效方法。糖尿病在许多中医药古籍中被称为消渴证，中医药在治疗糖尿病方面具有完整的理论体系和丰富的临床经验[2]，但目前中医辨证分型标准不统一、证名不规范及每一证型没有证候的主次等[3-4]，无疑是中医药干预糖尿病治疗的短板。因此，进行该方面规范化、客观化的研究很有必要。

对糖尿病的研究，多年来许多学者认为，中医与西医格格不入，然而在系统生物学时代找到了共同前进的道路。随着系统生物医学模式的建立，现代医学的研究正由微观角度的探索逐步转向宏观。可预见以整体观念和辨证论治为特点的现代中医学融入当前系统生物学的学术研究成为必然趋势[5]。代谢组学是系统生物学的代表，借助高通量、高灵敏度与高精确度的现代分析技术，分析细胞、组织和血液或尿液及其生物样本中内源性代谢物，并通过代谢物复杂、动态变化辨识和解析被研究对象的生理病理状态[6]。代谢组学研究具有整体、动态、综合的特点，能从代谢网络终端表象的整体角度反映生物体的功能水平，与中医学的系统观、整体观相近。因此，代谢组学技术具有揭示证候系统化、动态化、整体化等特点，从而可以作为中医证候研究的新技术平台。本文基于超高效液相色谱法（ultra high performance liquidchromatography，UPLC）-四极杆飞行时间（quadrupole time of flight，QTOF）-质谱（mass spectra，MS）/MS的代谢组学技术分析2型糖尿病不同中医证型的血清代谢物变化规律，旨在探求2型糖尿病的中医证候本质。

1 资料与方法

1.1 资料

1.1.1 一般资料 选择2013年6月至2014年4月本院内分泌科住院并确诊为2型糖尿病患者90例，其中男46例，女44例。健康对照组为本院体检中心经检查排除糖尿病、内分泌等疾病的健康志愿者30例，其中男15例，女15例。90例患者中医证型及性别分布见表1。

表1 90例患者中医证型及性别分布（n）

1.1.2 诊断标准 中医辨证分型参照文献[7]中消渴证（糖尿病）的中医辨证标准执行，分为阴虚热盛、气阴两虚、血淤气滞3种证型。

1.1.3 排除标准[8]（1）糖尿病急性并发症者（包括糖尿病低血糖症、糖尿病高渗性昏迷、糖尿病酮症及酮症酸中毒、糖尿病乳酸性酸中毒、糖尿病急性感染）；（2）严重心、肝、肾等并发症或合并其他严重原发性疾病、精神病患者；（3）年龄小于30岁或大于70岁；（4）妊娠期、哺乳期妇女；（5）不符合诊断标准，资料不全者。

1.1.4 材料与试剂 甲酸（色谱纯）、甲醇（色谱纯）、乙腈（色谱纯）均购于德国Merck公司，1，2-13C2-肉寇酸购于Sigma-Aldrich公司，超纯水由Millipore-Q3系统制得（Millipore，美国），飞鸽高速冷冻离心机购于上海飞鸽公司，Speed-vac浓缩仪购于 Thermo Savant美国，UPLC-QTOF-MS/MS购于美国ABsciex公司，安捷伦ZORBAXC18色谱柱（3.0 mm×50 mm，1.8 μm）购于美国安捷伦公司。

1.2 方法

1.2.1 血清采样方法 采集研究对象空腹12 h以上、次日早晨肘静脉血2 mL，4 000 r/min离心10 min，移取血清，-80℃冰箱保存，统一送至南京中医药大学仪器分析中心进行血清代谢组学检测。

1.2.2 血样处理 在0.2 mL血清中加入0.5 mL含有内标肉寇酸的甲醇溶液，涡旋振荡5 min后在4℃下静置30 min，然后4℃、10 000 r/min离心10 min，取上清液于试管中，用氮气吹干溶剂，加入0.2 mL甲醇复溶，涡旋振荡3 min，4℃、10 000 r/min离心10 min，吸取上清液进行UPLC-QTOF-MS/MS检测[9]。

1.2.3 数据采集和处理

1.2.3.1 液相条件 0.1%甲酸（A）、0.3%甲酸乙腈（B）梯度洗脱（0～10 min，5%～100%B），流速0.4 mL/min，柱温40℃，进样量2 μL。

1.2.3.2 质谱条件 采用飞行时间（time of flight，TOF）MS-IDA-MS/MS、正离子检测模式，喷雾电压5 500 eV，离子源温度550℃，气帘气40 psi，雾化气60 psi，辅助气60psi，去簇电压70eV，TOFMS扫描范围：50～1500m/z；IDA条件下设置：碰撞电压35eV，碰撞电压差10 eV，开启动态背景扣除。

1.3 统计学处理 应用AnalystTF1.6软件采集数据，应用Markview1.2.1软件进行峰提取、峰对齐及归一化等处理。数据分析和建模均应用SIMCA-P11软件（Ume大学，瑞典）完成。以内标标准化的矩阵X（实验样本）和矩阵Y（峰面积）相互关联建模，采取偏最小二乘-判别式分析（partial least squares-discriminant analysis，PLS-DA）的统计方法。PLS-DA集合了主成分分析、典型相关分析和多元线性回归分析等3种分析方法的优点。不但能提取原有信息的综合指标，而且还具有主成分分析法无法比拟的预测功能。其样品分布图可将不同组的样本分成不同簇，在PLS-DA变量分布图中可寻找出对该种区分有贡献的差异变量。如果继续对这些差异变量进行统计学处理，集合代谢组学差异性化合物数据库，便可寻找出具有显著差异的变量，即可能为病理研究的生物标志物。

2 结 果

2.1 不同中医证型2型糖尿病PLS-DA图 2型糖尿病的3种中医证型两两均可明显区分，3种中医证型患者血清内源性代谢物存在显著差异；阴虚热盛、血淤气滞2种证型相距较近，这2种证型均是虚证，与气阴两虚型实证可区分开，且二者血清内源性代谢物也存在显著差异，见图1。

图1 不同中医证型2型糖尿病PLS-DA图

2.2 不同中医证型2型糖尿病及健康对照组PLS-DA图 2型糖尿病的3种中医证型两两可明显区分，且与健康对照组也可明显区分。不仅3种中医证型2型糖尿病彼此之间血清内源性代谢物存在显著差异，且2型糖尿病的不同中医证型与健康对照组血清内源性代谢物也存在显著差异，见图2。

图2 不同中医证型2型糖尿病及健康对照组PLS-DA图

3 讨 论

辨证论治是中医的核心思想，“证候”是中医整体观、辨证观的统一。目前，糖尿病患者的临床表现发生了较大变化，旧理论远不足以对现今的糖尿病中医证型进行概括，现代药物的不断更新，对糖尿病的发病方式进行了干预，使其辨证论治越发困难。针对这种错综复杂的情况，需要有新的理论、新的依据指导辨证论治。另外由于各专家、学者对糖尿病的认识和理解存在差异，没有形成统一的辨证分型标准，这也需要现代研究推动理论前进，制订出一套令大众信服的辩证指导理论服务于临床。

本研究采用血清代谢组学研究方法，对90例2型糖尿病不同中医证型患者及30例健康志愿者进行了血清代谢组学研究，应用UPLC-QTOF-MS/MS方法测定血清内源性代谢物，并对数据进行PLS-DA，应用SIMCAP11软件绘制变量分布图。PLS-DA图揭示，不仅2型糖尿病患者与健康者血清内源性代谢物存在显著差异，且不同证型患者血清内源性代谢物也存在显著差异。本研究还创新性地对中医证型进行了虚、实证分类，结果显示，2型糖尿病患者虚、实证血清内源性代谢物也存在显著差异。

本研究对提高临床辨证论治水平、提高患者生活质量具有重大意义。但本研究还存在一些缺陷，如样本量较小等问题，需进一步进行大规模临床观察，作者后续将进行这方面的研究，从症状的规范化、如何将中医传统规范的“证”和西医诊断完整的“病”结合起来、完成新的辨证体系等方面进行探讨。

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[2]SuYX，HongJ，YanQ，etal．Increasedserumretinol-bindingprotein-4levels in pregnant women with and without gestational diabetes mellitus[J].Diabetes Metab，2010，36（6 Pt 1）：470-475.

[3]王洪霞，胡晓灵.糖尿病中医证型研究近况[J].中医文献杂志，2008，26（3）：47-48.

[4]李晋宏，曲竹秋.203例2型糖尿病的中医辨证分型研究[J].河南中医，2004，24（3）：38-39.

[5]潘明，陈琼.中医体质、病证研究与代谢组学[J].上海中医药杂志，2008，42（6）：53-56.

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[7]国家药品食品监督管理局.中药新药临床研究指导原则[M].北京：中国医药科技出版社，2002：233-237.

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Metabolomic study on traditional Chinese medicine syndrome types of type 2 diabetes mellitus based on UPLC-QTOF-MS/MS

Chen Aijuan，Wu Fang，Chen Wei
（Suzhou Municipal Hospital of Traditional Chinese Medicine，Jiangsu 215009，China）

ObjectiveTo study the relationship between the traditional Chinese medicine syndrome differentiation and excess or deficiency syndrome in type 2 diabetes mellitus（T2DM）with the serum metabolomics based on UPLC-QTOF-MS/MS by combining the traditional Chinese medicine differentiation method with the modern systematic biological theory．Methods90 inpatients diagnosed as T2DM in our hospital from June 2013 to April 2014 were selected and divided into 3 kinds of syndrome type including the type of Yin deficiency and intense heat，type of deficiency of both Qi and Yin and type of Qi stagnancy and blood stasis.The endogenous metabolites in the healthy individuals and different Chinese medicine syndrome types of T2DM were detected by the UPLC-QTOF-MS/MS method.Then the metabolic profiling was analyzed by using the partial least squares discriminant（PLS-DA）method.ResultsThe PLS-DA analysis results showed that this method not only effectively distinguished the disease group from the healthy control group，but also differentiated the three syndrome types of Yin deficiency and intense heat，deficiency of both Qi and Yin，and Qi stagnancy and blood stasis in T2DM patients.ResultsThe metabolomic technique based on UPLC-QTOF-MS/MS and pattern recognition has the extensive application prospects in revealing the essence of traditional Chinese medicine and clinical research of T2DM.

Metabolism；Diabetes mellitus，type 2；TCM science；Syndrome differentiation classification；Ultra high performance liquid chromatography-quadrupole time of flight-mass spectra

10.3969/j.issn.1009-5519.2015.17.002

A

1009-5519（2015）17-2572-03

2015-04-24）

苏州市科技计划项目（SYS201423）。

陈爱娟（1977-），女，江苏苏州人，主管中药师，主要从事中药学及仪器分析工作；E-mail：525405952@qq.com。

陈伟（E-mail：540584399@qq.com）。