HPLC法测定青蒿琥酯阿莫地喹片中青蒿琥酯的含量

蒋红艳,曾雪,陈义娟

(重庆医药高等专科学校 药学院，重庆 400030)



HPLC法测定青蒿琥酯阿莫地喹片中青蒿琥酯的含量

蒋红艳,曾雪,陈义娟

(重庆医药高等专科学校 药学院，重庆 400030)

目的 建立梯度洗脱HPLC 法测定青蒿琥酯阿莫地喹片中青蒿琥酯含量。方法 色谱柱为Wondasil C18-WR，流动相采用乙腈-磷酸水溶液(pH=3)的二元梯度洗脱，检测波长为210 nm；流速为1 mL/min；柱温为30 ℃。结果 青蒿琥酯在0.2～3.2 mg/mL范围内线性关系良好(r=0.9997)，平均加样回收率为99.0%(RSD=1.35%，n=6)。结论 该方法准确、灵敏，重现性好，可作为该制剂的质量控制方法。

梯度洗脱；HPLC；青蒿琥酯阿莫地喹片；青蒿琥酯

青蒿琥酯阿莫地喹片是由青蒿琥酯和阿莫地喹组成的复方制剂，临床主要用于治疗疟疾急性发作，控制疟疾症状。其中青蒿琥酯为青蒿素的衍生物，青蒿琥酯对疟原虫红内期有强大且快速的杀灭作用，快速清除疟原虫, 迅速控制疟疾症状。青蒿琥酯在碱性条件下稳定性更好，杀灭疟原虫的作用更强, 对耐药恶性疟疾也有很好的治疗作用。青蒿琥酯单药治疗疟疾作用显著，联合治疗疟疾效果更佳[1-2]。青蒿琥酯阿莫地喹片是临床常用的复方制剂，其中青蒿琥酯可延缓阿莫地喹的耐药性，而阿莫地喹能降低青蒿琥酯治疗后的疟疾复发率，2者取长补短，提高抗疟疾效果[3-4]。已有文献报道青蒿琥酯的含量检测方法有紫外分光光度法[5]、高效液相色谱法[6-10]、高效液相色谱-ELSD 法[11]、高效薄层色谱法[12]等，都取得了较为满意的结果。本实验采用梯度洗脱HPLC法测定青蒿琥酯阿莫地喹片中青蒿琥酯的含量，以期找出一种简单、准确的测定青蒿琥酯含量的方法。

1 材料与方法

1.1 实验仪器 LC-15C岛津液相色谱仪，SPD-15C检测器，Lcsolution 15C工作站(日本岛津)；色谱柱(Wondasil C18-WR，5 μm，日本岛津)；FA2104S电子天平(上海舜宇恒平科学仪器有限公司)；UV-6100PC双光束紫外/可见分光光度计(上海美谱达有限公司)。

1.2 药品与试剂 青蒿琥酯对照品(纯度为99.7%，中国药品生物制品检定所，批号：100200-201003)；青蒿琥酯阿莫地喹片(桂林南药股份有限公司，批号为SH140303，SH140601，SH140801)；甲醇、乙腈为色谱纯，水为超纯水；其余试剂均为分析纯。

1.3 方法

1.3.1 青蒿琥酯对照品溶液的制备：精密称取青蒿琥酯对照品32.0 mg， 置于10 mL量瓶中, 加入甲醇使其溶解, 稀释至刻度, 摇匀, 制成每1 mL含3.2 mg的对照品溶液。

1.3.2 青蒿琥酯阿莫地喹片供试品溶液的制备：取10片药品，称定总量后，将片剂放置于研钵中研磨成细粉，精密称取粉末(相当于50 mg青蒿琥酯)，置于25 mL量瓶中，加入甲醇稀释至刻度，超声30 min，用定量滤纸过滤，滤液再以0.22 μm 微孔滤膜滤过，精密量取续滤液2.5 mL置于10 mL量瓶中，用甲醇稀释至刻度，摇匀得供试品溶液。

1.3.3 青蒿琥酯的含量测定

① 光谱扫描：取上述1.3.1对照品溶液1 mL，加甲醇并稀释至100 mL，摇匀。在190～400 nm范围内进行全波长扫描，寻找青蒿琥酯最佳吸收波长。

② 色谱条件：流动性：乙腈-磷酸水溶液(pH=3)为有机相和水相；波长：210 nm；柱温：30 ℃；进样量：20 μL；流速：1 mL/min。采用二元梯度洗脱，梯度洗脱程序如下：0～5 min，26%～39%乙腈；6～10 min，40%～54%乙腈；11～30 min，55%～80%乙腈；31～40 min，81%～100%乙腈；41～45 min，100%～26%乙腈。理论塔板数(按青蒿琥酯计算)不小于30 000 。

③ 绘制标准曲线：将青蒿琥酯对照品以甲醇稀释分别得0.2 、0.4 、0.8、1.6和3.2 mg/mL对照品溶液, 依次进样20 μL, 记录峰面积，绘制标准曲线，并分析计算青蒿琥酯回归方程。

④ 重复性试验：称取同一批青蒿琥酯阿莫地喹片样品(批号为SH140303)，按照1.3.2项下的方法制备供试品溶液共6份，依法测定,记录峰面积。

⑤ 稳定性试验：称取同一批青蒿琥酯阿莫地喹片样品(批号为SH140303)，按照1.3.2项下的方法制备供试品溶液, 在24 h内, 间隔4 h进样1次, 依法测定, 记录峰面积。

⑥ 精密度试验：称取同一批青蒿琥酯阿莫地喹片样品(批号为SH140601)，按照1.3.2项下的方法制备供试品溶液, 连续进样6次, 每次20 μL, 依法测定, 记录峰面积。

⑦ 加样回收率试验：精密称取6 份已知青蒿琥酯含量的样品(批号为SH140601), 按1.3.2项下供试品溶液的制备方法配制样品, 分别精密加入一定量的对照品溶液, 用甲醇定容至刻度, 摇匀, 依次进样20 μL, 测定峰面积, 计算回收率。

⑧ 检测限和定量限试验：取0.2 mg/mL青蒿琥酯对照品溶液，逐级稀释后进样，并以流动相为空白溶液进样，测定，记录色谱图。按照信噪比为3:1计算检测限，按照信噪比为10:1计算定量限。

⑨ 青蒿琥酯含量测定：取3批样品(批号为SH140303，SH140601，SH140801)， 按照1.3.2制备方法制备供试品溶液， 取20 μL 进样，测定青蒿琥酯含量。

2 结果

2.1 青蒿琥酯标准曲线的绘制

2.1.1 检测波长的选择：在190～400 nm范围内全波长扫描图谱见图1，结果显示青蒿琥酯在203 nm波长处有最大吸收，但为了避免甲醇、乙腈等溶剂末端吸收的影响，故选择210 nm作为检测波长。

图1 紫外波长扫描图谱Fig.1 Scanning spectra of UV wavelength

2.1.2 青蒿琥酯的标准曲线：以青蒿琥酯峰面积(Y)对青蒿琥酯浓度(X)绘制标准曲线，得标准曲线Y=770638X-6909.9，r=0 .9997，线性范围为0.2～3.2 mg/mL。见图2。

图2 青蒿琥酯标准曲线Fig.2 Standard curve of artesunate

2.1.3 重复性试验：按照1.3.3项下的④进行试验，测定峰面积的RSD为1.82%(n=6)，结果表明该方法重复性好。

2.1.4 稳定性试验：按照1.3.3项下的⑤项进行试验，测定峰面积的RSD 为1.23 %(n=6), 结果表明供试品溶液在24 h内稳定。

2.1.5 精密度试验：按照1.3.3项下的⑥项进行试验，测定峰面积的RSD 为1.87 %(n=6)，表明该方法精密度较好。

2.1.6 加样回收率试验：按照1.3.3项下的⑦项进行试验，测定峰面积, 计算回收率，平均回收率为99.0%，RSD 为1.35%。见表1。

表1 青蒿琥酯加样回收率试验结果(n=6)Tab.1 Recovery of artesunate (n=6)

2.1.7 检测限和定量限：按照1.3.3项下的⑧项进行试验，检测结果显示，该方法的检测限为0.25 μg，定量限为0.83 μg。

2.1.8 含量测定：分别取青蒿琥酯对照品溶液及青蒿琥酯阿莫地喹片供试品溶液各20 μL, 注入高效液相色谱仪中并记录色谱图，见图3、图4。按照外标法计算青蒿琥酯的含量。3批供试品(批号: SH140303，SH140601，SH140801)的含量分别为99.2 %、98.8%、100.5%。

图3 青蒿琥酯对照品色谱图Fig.3 HPLC of artesunate reference substance

图4 青蒿琥酯供试品色谱图Fig.4 HPLC of artesunate test solution

3 讨论

3.1 测定波长的选择 有文献报道青蒿琥酯的检测波长有205 nm[6]、237 nm[13-14]、289 nm[5]等，本实验对青蒿琥酯对照品溶液在190～400 nm的波长范围内进行全波长扫描，结果在203 nm处有最大吸收。为了保证检测的灵敏度, 同时避免甲醇、乙腈等溶剂末端吸收的影响，本实验选择210 nm作为检测波长。

3.2 流动相的选择 在实验过程中分别考察了流动相为乙腈-水、甲醇-水、甲醇-Na2HPO4-NaH2PO4(pH=3)、乙腈-磷酸水溶液(pH=3)等4 种流动相对本品的洗脱实验, 结果表明在流动相乙腈-水、甲醇-水、甲醇-Na2HPO4-NaH2PO4(pH=3)中，峰形较差，拖尾现象较明显；而在流动相乙腈-磷酸水溶液(pH=3)中的保留时间适中，拖尾因子和对称因子均符合要求。故本实验选择乙腈-磷酸水溶液(pH=3)作为流动相，得到了较好的分离效果。

3.3 洗脱梯度的确定 采用乙腈为流动相A，磷酸水溶液为流动相B，不同时间更换不同的比例，青蒿琥酯检测波长为210 nm，最后确定本实验洗脱程序。

梯度洗脱是使溶剂强度在色谱过程中逐渐增加，在一个分析周期中按照一定程序不断改变流动相的浓度配比, 从而使复杂样品中的性质差异较多的组分达到很好的分离效果[15]。梯度洗脱HPLC可以缩短分析时间，提高分离度，改善峰形，但由于是多种溶剂混合，且组成不断变化，有可能引起基线漂移和降低重现性[16]。因此梯度洗脱所用的溶剂纯度要求更高，以保证获得良好的重现性。

本实验通过考察波长、流动相、流动相的梯度以及流速对实验结果的影响，最后确定流动相为乙腈-磷酸水溶液(pH=3)，采用二元梯度洗脱，流速为1 mL/min，保留时间为16 min，该方法灵敏度高，保留时间适中，且峰形较好，得到了较好的分离效果。本文采用梯度洗脱HPLC法对青蒿琥酯阿莫地喹片中青蒿琥酯进行了含量测定。该方法简便、准确、重现性好，可以用于青蒿琥酯的质量控制。

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(编校：王冬梅)

Determination of artesunate in artesunate and amodiaquine hydrochloride tablets by HPLC

JIANG Hong-yan,ZENG Xue,CHEN Yi-juan

(College of Pharmacy, Chongqing Medical and Pharmaceutical College, Chongqing 400030, China)

ObjectiveTo establish an HPLC method for the determination of artesunate in artesunate and amodiaquine hydrochloride tablets.MethodsWondaSil C18-WR column was used with mobile phase consisted of acetonitrile:phosphoric acid aqueous solution(adjust pH to 3，gradient elution);wavelength was 210 nm; flow rate was 1 mL/min and the column temperature was 30 ℃.ResultsThe standard curve was linear in the range of 0.2～3.2 mg/mL(r=0.9997), average recoveries were 99.0%(RSD=1.35%,n=6).ConclusionThe method is accurate and sensitive, and it can be used to control the quality of artesunate and amodiaquine hydrochloride tablets.

gradient elution;HPLC;artesunate and amodiaquine hydrochloride tablets;artesunate

重庆市教委科研项目(KJ1402601)；重庆市卫生局医学科研项目(2012-1-093)；重庆市卫生局中医药科技项目(2012-2-17)

蒋红艳，女，硕士，副教授，研究方向：从事中药药理的研究，E-mail：jianghy200568@126.com。

R927

A

1005-1678(2015)03-0166-03