SULT1A3与芹菜素的磺酸化结合反应的动力学特征研究

蒋昆谕,吕晓,周昱,周一平,马颖林,孟胜男

(中国医科大学药学院 药剂教研室，辽宁 沈阳 110013)



SULT1A3与芹菜素的磺酸化结合反应的动力学特征研究

(中国医科大学药学院 药剂教研室，辽宁 沈阳 110013)

目的 研究人重组酶SULT1A3与芹菜素的磺酸化结合反应的动力学特征。方法 采用高效液相色谱法，测定芹菜素的消除量及其磺酸化结合反应代谢产物的生成量，并应用LC-MS/MS液质联用技术鉴定其结构。建立芹菜素与重组酶SULT1A3体外反应体系，测定SULT1A3催化不同浓度芹菜素的磺酸化结合反应代谢速率，采用GraphPad Prism 5软件对其进行酶动力学分析。结果 芹菜素在0.15625～30 μM范围内线性关系良好，平均回收率大于80%，日内和日间的RSD均小于15%。芹菜素与SULT1A3孵育体系中的代谢产物为单磺酸化结合产物。芹菜素与人重组酶SULT1A3的反应呈底物抑制动力学特征。芹菜素与SULT1A3酶反应的动力学参数Km和Ksi分别为(0.355±1.04)、(23.62±0.06) μM，Vmax为(65.71±1.30) nmol/(min·mg)，Vmax/Km为185.10 mL/(min·mg)。结论 人重组酶SULT1A3可介导芹菜素的磺酸化结合反应，且其酶动力学特征呈现底物抑制效应。推测由SULT1A3介导的磺酸化结合反应可能在芹菜素的体内II相代谢中发挥重要的作用。

芹菜素；SULT1A3重组酶；磺酸化代谢；动力学特征

图1 芹菜素结构图Fig.1 Structure of apigenin

芹菜素(apigenin, API)是一类广泛存在于蔬菜和水果中的黄酮类化合物，化学名为4’,5,7 -三羟基黄酮，见图1[1]。对多种肿瘤具有抑制生长，诱导凋亡的作用，此外还具有预防高血压、抗炎、抗氧化等药理作用[2-4]。但是由于芹菜素的理化性质，水溶性较差，生物利用度较低，在一定程度上限制了它的应用。研究发现芹菜素在人体内存在强烈的Ⅱ相代谢反应，这是导致其生物利用度低的主要原因[5-6]。由磺基转移酶(sulfotransferases, SULTs)介导的磺酸化结合反应是一种重要的Ⅱ相代谢反应。SULT1A3是SULTs超基因家族中的一个重要的亚酶，在人体内尤其是小肠内表达量多，底物谱广泛且多为儿茶酚胺类化合物[7-8]。目前，SULT1A3是否在芹菜素的磺酸化代谢中发挥作用以及其代谢特性尚不清楚。本文应用人重组SULT1A3与芹菜素的体外孵育体系，考察芹菜素的磺酸化代谢特性，为进一步阐明芹菜素的体内代谢行为，促进其在临床合理、有效应用提供理论基础和科学指导。

1 材料与方法

1.1 仪器 HPLC- waters 2695，2489 UV检测器；API 3200 Q Trap三重四极杆质谱(Applied Biosystem/MDS SCIEX， Foster City， CA)；SHA-CA恒温水浴震荡器(金坛市精达仪器制造厂)；紫外分光光度计TU-1901(北京普析通用仪器有限责任公司)；TLL-C高速冷冻离心机(北京四环科学仪器厂)；METTLER TOLEDO AL104分析天平、METTLER TOLEDO 320 pH计(瑞士梅特勒-托利多)。

1.2 药品与试剂 芹菜素(陕西慧科，纯度>99%)；人重组酶SULT1A3(英国Cypex)；3’-磷酸腺苷-5’-磷酰硫酸(3′-Phosphoadenosine 5′-phosphosulfate， PAPS)(美国sigma)；色谱纯乙腈(天津康科德)；醋酸铵、盐酸、磷酸氢二钾、磷酸二氢钾(分析纯)；超纯水(Millipore)。

1.3 色谱与质谱条件 色谱分析条件为：色谱柱：Thermo-C18(250 mm×4.6 mm，5 μM)；流动相：乙腈(A)-(2.5 mM)pH4.5醋酸铵水溶液(B)，梯度洗脱，0～2 min，10%～25%A ；2～3 min，25%～40%A ；3～5 min，40%～60%A ；5～9 min，60%～65%A；9～15 min，65%～80%A；15～16 min，80%～90%A；16～18 min，90%～10%A；18～20 min，10%A。内标：睾酮。进样量：20 μL。流速：1 mL/ min。本实验采用双通道紫外检测波长：254 nm(内标)和340 nm(芹菜素及其代谢产物)。柱温：30 ℃。采用液相色谱质谱方法测定芹菜素及其磺酸化代谢产物。质谱分析条件：负离子方式检测；离子喷雾电压：-4.0 kV；源温度：400 ℃；喷雾气(gas l)：氮气，40 psi；涡轮气(gas 2)：氢气，20 psi；保护气：氮气，20 psi。采用一级全扫描质谱及选择离子全扫描二级质谱2种方式同时测定。

1.4 体外代谢系统孵育条件及样品处理 芹菜素的磺酸化代谢反应 芹菜素与SULT1A3的酶动力学实验：取系列浓度的芹菜素适量，分别加入50 mM KPI缓冲液中(pH7.4)，加入SULT1A3酶(终浓度为0.00267～0.0053 mg/mL)，最后加入0.1 mM PAPS溶液启始反应，孵育体系总体积为200 μL，混匀，37 ℃水浴孵育一定时间后，加入预冻的50 μL的100 μM睾丸酮溶液终止反应[9-10]。

样品处理：反应终止后，样品进行涡旋60 s后进行离心(4 ℃， 7700×g)，离心20 min，取上清液进行HPLC及HPLC/MS/MS分析测定，进样量20 μL。

底物抑制动力学方程：

V为酶反应速率，C为底物浓度，Vmax为高亲和状态时的最大反应速率，Km是达到Vmax一半时底物的浓度，Ksi是底物抑制常数[11]。

2 结果

2.1 方法学验证

2.2.1 线性与专属性：在本实验的检测条件下，本方法具有良好的专属性，芹菜素及其代谢产物峰形良好，无内源性杂质干扰。芹菜素标准曲线方程为y=0.042x-0.011，相关系数R2=0.999，其中y代表芹菜素与内标睾酮峰面积的比值，x代表芹菜素的浓度。芹菜素代谢产物浓度在0.15625～30 μM范围内具有良好的线性关系。

2.2.2 回收率与精密度：芹菜素在人重组SULT1A3酶中浓度分别为2.5、10、30 μmol/L 时，提取回收率(n=6) 分别为(89.23±5.50)%、(88.27±3.45)%、(86.30±4.86)%。日内精密度 RSD(n=6)分别为 2.01%、0.43%、0.46%; 日间精密度 RSD(n=6)分别为3.57 %、2.28%、2.35%。

2.2 芹菜素磺酸化结合产物HPLC图谱的确认与定量 芹菜素与SULT1A3孵育体系反应后，产生一种磺酸化代谢产物(API-S)，其出峰时间为7.1 min，该峰位于母体(API)的前面，芹菜素的保留时间为8.5 min，见图2。该代谢产物在不加PAPS的体系中则不产生。由于无市售芹菜素磺酸化代谢产物，因此本研究基于其母体芹菜素的标准曲线，以及确定两者之间的转换因子K并进行校正，从而对芹菜素代谢产物进行定量。本实验测得的芹菜素磺酸化代谢产物与芹菜素之间的转化因子K值为1.18。具体操作参见文献[12]。

芹菜素在SULT1A3空白孵育体系(不加PAPS) 芹菜素在SULT1A3孵育体系图2 芹菜素在SULT1A3孵育体系的HPLC 色谱图Fig.2 HPLC profile of API and API-S in SULT1A3

2.3 LC/MS/MS鉴定芹菜素的磺酸化代谢产物 本实验采用LC/MS/MS技术进一步鉴定芹菜素及其代谢产物的结构。质谱检测结果显示，样品产生的准分子离子峰[M-H]-m/z为349.2，与芹菜素的磺酸化结合产物的相对分子质量(350.2)相吻合。另一分子离子峰m/z为268.6 与准分子离子峰的相对分子质量相差80，推断其为[M-SO3]-，即丢失1个磺酸基碎片所致。由此可确认代谢产物即为芹菜素磺酸化结合反应产物。见图3。

图3 芹菜素及其代谢产物的质谱图Fig.3 LC-MS/MS profile of apigenin and its metabolites

2.4 芹菜素在人重组SULT1A3中代谢的酶动力学考察 芹菜素与SULT1A3的酶促动力学曲线见图4，其对应的Eadie-Hofstee见图5。芹菜素与SULT1A3的反应呈现底物抑制的动力学特点，即SULT1A3介导的芹菜素磺酸化代谢反应速率随芹菜素浓度增大而升高，而当芹菜素浓度大于4 μM时则逐渐降低。SULT1A3介导芹菜素的动力学参数Km和Ksi分别为(0.355±1.04)，(23.62±0.06) μM，Vmax为(65.71±1.30)nmol/(min·mg)，Vmax/Km为185.10 mL/(min·mg)。

图4 芹菜素与SULT1A3的酶促反应动力学曲线图Fig.4 Kinetic curve of SULT1A3 catalyzed metabolism of apigenin

图5 芹菜素与SULT1A3的酶促反应的Eadie-Hofstee图Fig.5 Eadie-Hofstee plot of SULT1A3 catalyzed metabolism of apigenin

3 讨论

磺酸化结合反应是内源性物质和外源性物质的重要代谢途径。在磺酸化结合反应中，SULT1A3将其辅因子3’-磷酸腺苷-5’-磷酰硫酸(PAPS)的亲电子硫基部分转移至芹菜素的酚羟基上，生成亲电子的硫酸酯类复合物[13-14]，使底物的亲水性增加，使其利于排泄。由于芹菜素具有3个酚羟基，本研究证明芹菜素磺酸化结合反应只产生一种代谢产物，即可推测PAPS只与芹菜素的1个酚羟基相结合，PAPS的亲电子硫基部分具体转移至哪个酚羟基上则需进一步研究。

本研究中SULT1A3介导的芹菜素磺酸化结合反应呈现底物抑制动力学特点，提示在高底物浓度下代谢速率减小。SULT1A3介导的芹菜素磺酸化代谢反应的Km较小，且Vmax/Km较大，说明芹菜素在与SULT1A3反应具有高亲和性和高体内清除率。而Riches等[15]证明的SULT1A3在人肠道内表达量较多，肝脏中几乎不表达，由此可推断由SULT1A3介导的磺酸化结合反应可能在芹菜素的体内II相代谢中发挥重要的作用，小肠可能是芹菜素磺酸化代谢的主要器官之一。后续研究将对芹菜素的II相代谢特征进行综合考察。

本研究首次明确了SULTs家族中由SULT1A3介导的芹菜素磺酸化代谢的酶动力学特性。了解芹菜素的代谢特点有助于解析芹菜素发挥药效和毒性反应的物质基础，并能提高其生物利用度的办法，将为芹菜素的药用开发及其在临床合理应用提供理论支持和科学指导。

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(编校：王冬梅)

Study on kinectics characteristics of the sulfation of apigenin by SULTIA3

JIANG Kun-yu,LV Xiao-yue,ZHOU Yu,ZHOU Yi-ping,MA Ying-lin,MENG Sheng-nanΔ

(Department of Pharmaceutics, School of pharmacy, China Medical University, Shenyang 110013, China)

ObjectiveTo investigate the kinectics characteristics of sulfation of apigenin mediated by SULTIA3.MethodsAfter incubation of apigenin using in vitro SULT1A3 system, high-performance liquid chromatography was utilized to determine the sulfates of apigenin. Mass spectrum(MS) were employed to elucidate the structure of metabolite. The program GraphPad Prism 5 was used to perform the kinetic characterization of SULT1A3 catalyzed metabolism of apigenin.ResultsA liner calibration curve for the assay of apigenin was validated in the range of 0.15625～30 μM with the recoveries of at least 80% and intra-day and inter-day RSD of less than 15%. Metabolic product of apigenin and SULT1A3 in the incubated system was identified one monosulfate. The metabolic behavior of apigenin in SULT1A3 was followed substrate inhibition kinetics. Apparent kinetic parameters of metabolism of apigenin by SULT1A3, Kmwas(0.355±1.04) μM and Ksiwas(23.62±0.06) μM，Vmaxwas(65.71±1.30) nmol/(min·mg)，Vmax/Kmwas 185.10 mL/(min·mg).ConclusionSULT1A3 can mediate the binding of apigenin sulfonated reaction, and the character of enzymatic kinetics shows substrate inhibition. Sulfation of apigenin mediated by SULTIA3 may play an important role in phaseⅡmetabolic in vivo.

apigenin; SULT1A3; sulfation; kinetic characterization

国家自然科学基金资助项目(81173123)；辽宁省自然科学基金课题(2013021080)

蒋昆谕，女，硕士，助教，研究方向：药物吸收与代谢特性，E-mail：cmu_kyjiang@163.com；孟胜男，通讯作者，女，博士，教授，研究方向：药物制剂及药物吸收与代谢特征，E-mail：shnmeng_16@163.com。

R963

A

1005-1678(2015)03-0153-03