黄芩苷对牙周炎大鼠牙移动保持阶段VEGF、BMP-2及IL-1β表达的影响

李玲

(莱芜市人民医院 口腔科，山东 莱芜 271199)



黄芩苷对牙周炎大鼠牙移动保持阶段VEGF、BMP-2及IL-1β表达的影响

李玲

(莱芜市人民医院 口腔科，山东 莱芜 271199)

目的 观察黄芩苷对牙周炎大鼠牙移动保持阶段血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)、骨形态发生蛋白2(bone morphogenetic protein，BMP-2)和白介素1β(interleukin，IL-1β)表达的影响，探讨黄芩苷对牙周组织改建的作用机制。方法 80只SD大鼠，随机分为4组，每组20只。空白组不作处理，模型组建立牙周炎模型，对照组与观察组均建立牙周炎模型，继而建立牙移动模型，观察组给予黄芩苷，空白组和对照组给予等量生理盐水，分别于1、3、6、12、18d时处死大鼠进行免疫组化染色，观察牙周组织VEGF、BMP-2和IL-1β的表达变化。结果 空白组大鼠BMP-2阳性表达不高，模型组BMP-2表达增强，对照组和观察组牙周组织BMP-2的表达在加力结束后逐渐降低，但相同时间点比较，观察组BMP-2表达量低于对照组(P<0.05)。对照组和观察组牙周组织VEGF表达量在加力结束后均较模型组显著降低，相同时间点比较，观察组VEGF表达量均高于对照组(P<0.05)。空白组IL-1β阳性表达不明显，模型组IL-1β阳性表达明显增多，对照组和观察组牙周组织IL-1β表达量在加力结束后逐渐降低，相同时间段组比较，观察组IL-1β表达量明显低于对照组(P<0.05)。结论 黄芩苷可显著减少牙周炎大鼠牙移动后牙周组织中IL-1β表达，降低炎症反应，抑制骨吸收；增加牙周组织中BMP-2和VEGF表达，促进牙周组织血管形成和成熟，这可能是黄芩苷促进牙周炎大鼠正畸牙移动后保持阶段内牙周组织改建的作用机制之一。

牙周炎；黄芩苷；VEGF；BMP-2；IL-1β

随着社会的不断发展，人们逐渐意识到错颌畸形是一种疾病，极大影响颜面美观和口腔功能，需及时接受正畸治疗。但是，成人矫治后出现的牙周炎问题正成为困扰医生的一大难题。牙周炎发病机制主要是由于菌斑及其毒性产物致使牙周组织炎症，并且激活宿主细胞，从而释放多种炎症介质[1-2]。一旦出现牙周炎，可导致牙槽骨吸收、牙周支持组织破坏，患牙受力失衡，从而影响牙齿咬合功能[3]。如何保持牙周炎患者牙齿稳定而理想的位置是正畸治疗后的关注重点，机械保持需长期使用，舒适度差；牙周手术风险性高，患者接受度较低[4]。近年来，药物治疗成为研究热点，研究报道显示，黄芩苷可抑制炎症因子，促进牙周膜细胞增殖，保护牙周膜细胞[5]。本文观察黄芩苷对牙周炎大鼠牙移动保持阶段VEGF、BMP-2和IL-1β表达的影响，旨在探讨黄芩苷对牙周组织改建的作用机制。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 试验动物：SD大鼠80只，雌雄各半，4周龄，体质量(100±10)g，由北京市实验动物研究中心提供(合格证号：Scxk(京)-2002-0003)，严格遵循《实验动物保护条例》，适应性饲养7 d后开始实验。

1.1.2 药品：黄芩苷购自北京生物制品检验所(纯度>99%)，取黄芩苷10 g，加注射用水适量悬浮浸润，滴加2 mol/L氢氧化钠溶液使黄芩苷溶解，配制成10 g/L的黄芩苷贮存液备用。

1.1.3 试剂与仪器：牙釉质粘结剂(杭州西湖生物材料有限公司)；速眠新(吉林省敦化市圣达动物药品有限公司)；多聚甲醛(上海抚生实业有限公司)；VEGF抗体、BMP-2抗体和IL-1β抗体(武汉博士德生物工程有限公司)；VEGF、BMP-2和IL-1β ELISA试剂盒(南京建成生物工程研究所)。

正畸用测力计(杭州奥索医疗器械有限公司)，YJZ-100型高速涡轮牙钻机(上海泰益医疗仪器设备有限公司)，高速涡轮牙钻手机(日本NSK公司)，倒置荧光显微镜(日本Olympus公司)。

1.2 方法

1.2.1 按照随机数字表法将80只SD大鼠分为空白组(A组)、牙周炎模型组(B组)、对照组(C组)和观察组(D组)4组，每组20只。A组不作任何处理，后采用心脏灌注法处死，制作组织学标本，进行免疫组化染色。B组大鼠建立牙周炎模型后采用心脏灌注法处死，制作组织学标本，进行免疫组化染色。C组大鼠建立牙周炎模型，继而建立牙移动模型，于加力装置去除前一天开始腹腔注射生理盐水，1次/天，分别于1、3、6、12、18d时心脏灌注处死，制作组织学标本，进行免疫组化染色。D组大鼠建立牙周炎模型，继而建立牙移动模型，于加力装置去除前1天开始腹腔注射黄芩苷溶液40mg/kg，1次/天，分别于1、3、6、12、18d时心脏灌注处死，制作组织学标本，进行免疫组化染色。

1.2.2 大鼠牙周炎模型建立：大鼠肌内注射0.25 mL/kg速眠新麻醉，动物麻醉后仰卧固定于手术台，采用高速涡轮牙钻机

在大鼠上颌双侧第一磨牙近中颊侧牙颈部磨一浅的固位沟，用口腔正畸结扎钢丝结扎双侧上颌第二磨牙牙颈部1圈。术后给予高糖饮食，喂养软食，30 d后形成大鼠牙周炎模型[6]。

1.2.3 大鼠牙移动模型建立：牙周炎模型大鼠麻醉后仰卧固定于手术台，用高速涡轮牙钻机在大鼠上颌2颗切牙远中磨一浅的固位沟，用结扎丝将螺旋弹簧的一端结扎于上颌第一磨牙牙颈部固位沟，另一端结扎在上颌切牙固位沟内牵引上颌双侧第一磨牙近中移动，清洁后酸蚀2颗切牙结扎丝周围牙面，干燥后用釉质粘结剂固定，共持续18d[7]。

1.2.4 牙移动后保持阶段动物模型建立：牙移动结束后去除大鼠口内加力装置，以左侧上颌牙弓作为实验的保持侧，以结扎丝连扎于左侧上颌第一磨牙和切牙之间，切牙结扎处涂布粘结剂固定，分别保持1、3、6、12、18d[8]。

1.2.5 免疫组化染色：各组大鼠灌注结束后解剖取出上颌骨，浸泡于4%多聚甲醛液中固定24 h。之后浸泡于10% EDTA液中于4 ℃脱钙约30 d。PBS冲洗干净组织块后石蜡包埋，从腭侧向颊侧的方向进行切片，选择断面为完整牙周韧带的切片进行观察，进行免疫组化染色。观察各组大鼠牙周组织IL-1β、BMP-2和VEGF的水平变化。

2 结果

2.1 各组大鼠牙周组织中BMP-2免疫组化染色结果分析 胞质内BMP-2阳性细胞以淡黄色和棕褐色颗粒为主，胞核和胞膜上少见。见图1。空白组大鼠BMP-2阳性表达不高，模型组BMP-2表达增强，牙槽骨表面可见新骨形成。对照组和观察组牙周组织BMP-2的表达在加力结束后逐渐降低，但相同时间点比较，观察组BMP-2表达量高于对照组(P<0.05)，见表1。

图1 各组大鼠牙周组织BMP-2免疫组化染色结果(×200)Fig.1 BMP-2 immunohistochemical staining results in periodontal tissues of rats(×200)

组别 只数BMP-2表达1d3d6d12d18d空白组460.33±2.14 64.92±2.89 68.31±3.02 90.04±2.78 93.21±2.51 模型组4265.31±3.57269.41±3.01274.98±2.35277.36±3.49284.56±2.69对照组4133.06±0.97126.94±1.56118.90±1.47111.91±2.25108.89±1.38观察组4139.18±1.01*130.85±1.21*125.01±3.24*116.76±1.90*112.89±1.51*

*P<0.05，与对照组比较，compared with control group

2.2 牙周组织中VEGF免疫组化染色结果分析 光学显微镜下观察可见，胞质内VEGF阳性细胞以淡黄色和棕褐色颗粒为主，胞核和胞膜上未见明显染色，主要分布于牙周膜、血管内壁和牙髓腔中，见图2。对照组和观察组牙周组织VEGF表达量在加力结束后均较模型组显著降低，相同时间点比较，观察组VEGF表达量均高于对照组(P<0.05)，见表2。

图2 各组大鼠牙周组织VEGF免疫组化染色结果(×200)Fig.2 VEGF immunohistochemical staining resultsin periodontal tissues of rats(×200)

组别 只数VEGF表达1d3d6d12d18d空白组476.35±4.0280.21±3.9883.51±2.9686.73±3.1187.21±2.65模型组4205.76±3.11211.84±2.81218.29±1.87226.33±2.65231.57±3.07对照组4121.93±1.51116.85±1.26112.80±1.50107.79±1.29104.79±1.27观察组4127.95±1.53*122.03±1.49*118.81±1.24*109.97±1.72*109.97±1.72*

*P<0.05，与对照组比较，compared with control group

2.3 牙周组织中IL-1β免疫组化染色结果分析 光学显微镜下观察，胞质内IL-1β阳性细胞以淡黄色和棕褐色颗粒为主，胞核和胞膜上未见。IL-1β表达阳性的细胞有成纤维细胞、单核-巨噬细胞、破骨细胞及中性粒细胞。由图3可见，空白组未见明显阳性染色，模型组IL-1β阳性表达明显增多。对照组和观察组牙周组织IL-1β表达量在加力结束后逐渐降低，相同时间段组比较，观察组IL-1β表达量明显低于对照组(P<0.05)，见表3。

图3 各组大鼠牙周组织IL-1β免疫组化染色结果(×200)Fig.3 IL-1β immunohistochemical staining resultsin periodontal tissues of rats(×200)

组别 只数IL-1β表达1d3d6d12d18d空白组487.32±2.0990.21±1.8783.57±1.6792.14±2.3596.31±1.93模型组4245.91±3.08263.84±2.68258.27±2.31273.41±1.95283.15±3.22对照组4116.97±1.10121.18±1.19125.10±1.54127.82±1.27132.01±1.16观察组4112.21±1.34*117.78±1.30*121.00±1.28*123.93±1.56*127.13±1.33*

*P<0.05，与对照组比较，compared with control group

3 讨论

近年来，成人正畸患者数急剧增加，大部分具有不同程度的牙周病损。牙周病已成为影响人类口腔健康的主要疾病，在全球范围内具有极高的患病率，而我国患病率更是高达95%。牙周炎的主要特征是牙周袋形成和袋壁的炎症、牙槽骨吸收，可导致患者牙齿松动和移位，继发畸形和殆创伤，是成人牙齿丧失的主要原因，严重危害人类健康[9]。目前，正畸治疗是牙周病治疗的重要手段。众多研究显示，药物治疗可达到控制牙齿移动，增加支持的目的。

黄芩苷是从唇形科植物黄芩(ScutellariabaicalensisGeorgi)的干燥根中提取而来，属于黄酮类化合物。现代药理学研究显示，黄芩苷生物活性显著，具有解热、降压、利尿、抗菌、抗炎、抗变态反应等多种作用[10-11]。近年来，通过不断探索黄芩苷对牙周炎的作用发现，黄芩苷可保护牙周膜成纤维细胞，促进牙周膜细胞增殖，抑制TNF-α，降低IL-6含量[12]。此外，黄芩苷对LPS介导的IL-1β也有抑制作用，显著促进成纤维细胞增殖及其胶原蛋白合成。

VEGF可促进血管内皮细胞分泌骨生长因子，刺激成骨细胞生长[13]。此外，VEGF还可能与成骨细胞迁移和分化相关，参与骨改建。BMP-2属于TGF-β超家族成员，决定骨祖细胞分化，是一种高效的骨诱导物质，可诱导间充质细胞向骨细胞系分化，加速矿化结节形成，参与牙齿移动过程中的骨改建[14]。因此，BMP-2可用来衡量骨形成是否活跃。IL-1是炎性因子级联反应的始动因子，其中IL-1β对维持机体稳态和心血管疾病具有重要调节作用。IL-1β是牙周炎的破坏因子，具有催化牙槽骨吸收的作用。众多研究显示，IL-1β可刺激骨吸收，抑制骨形成，抑制金属蛋白酶组织抑制因子，从而导致结缔组织降解[15]。因此，本文以VEGF、BMP-2和IL-1β作为检测指标评价黄芩苷对牙周炎大鼠牙移动保持阶段牙周组织抗炎方面的骨改建作用。

本研究结果显示，对照组和观察组牙周组织BMP-2和VEGF表达量在加力结束后呈逐渐减少的趋势，相同时间点比较，实验组BMP-2和VEGF表达量均高于对照组(P<0.05)。而对照组和观察组牙周组织IL-1β表达量在加力结束后逐渐增加，相同时间点比较，实验组IL-1β表达量明显低于对照组(P<0.05)。综上所述，黄芩苷可显著减少牙周炎大鼠牙移动后牙周组织中IL-1β表达，降低炎症反应，抑制骨吸收；增加牙周组织中BMP-2和VEGF表达，促进牙周组织血管形成和成熟，这可能是黄芩苷促进牙周炎大鼠正畸牙移动后保持阶段内牙周组织改建的作用机制之一。

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(编校：王俨俨)

Effect of baicalin on expression of VEGF, BMP-2 and IL-1β in rat mobile dental periodontitis maintained phase

LI Ling

(Department of Stomatology, People’s Hospital of Laiwu City, Laiwu 271199, China)

ObjectiveTo observe effect of baicalin on VEGF, BMP-2 and IL-1β expression in rat mobile dental periodontitis maintained phase, and explore the mechanism of baicalin on periodontal tissue remodeling.Methods80 SD rats were randomly divided into four groups,20 rats in each group. The blank group weren’t giren any treatment, model group were built with periodontitis, control group and observation group were built with periodontitis and then tooth movement model. The observation group were given baicalin, blank group and control group were given the same volume of saline. The rats were killed at 1d, 3d, 6d, 12d, 18d, then samples of the maxilla were taken to make tissue sections and immunohistochemical staining. VEGF, BMP-2 and IL-1β expression were observed in periodontal tissue.ResultsThe BMP-2 expression isn’t obvious in blank group, but was obvious in model group, and gradually reduced at the end of the afterburner; BMP-2 expression in experimental group were higher than that in control group at the same point (P<0.05). The VEGF expression in control group and experimental group gradually reduced at the end of the afterburner; VEGF expression in experimental group were lower than that in control group at the same point (P<0.05). The IL-1β expression wasn’t obvious in blank group, but was obvious in model group. The IL-1β expression in control group and experimental group gradually reduced at the end of the afterburner; IL-1β expression in experimental group were lower than that in control group at the same point (P<0.05).ConclusionBaicalin can significantly increase the expression of IL-1β in periodontal tissues of periodontitis rats after moving teeth, reduce inflammation, inhibit bone resorption, and also increase BMP-2 and VEGF expression, promote periodontal vessel formation and maturation, which may be one of the mechanisms of baicalin to promote periodontal tissue remodeling in periodontitis rats at holding phase after orthodontic tooth movement.

periodontitis; baicalin; VEGF; BMP-2; IL-1β

李玲，女，主治医师，学士，研究方向：口腔，E-mail：liling15763499755@163.com。

R781.42

A

1005-1678(2015)03-0032-04