止咳口服液提取工艺研究

朱雪梅，王晓芬，陈永财，刘刚，陈凌云

(1.温州市中医院，浙江 温州 325000；2.温州市药检所，浙江 温州 325000)



止咳口服液提取工艺研究

朱雪梅1，王晓芬1，陈永财1，刘刚1，陈凌云2

(1.温州市中医院，浙江 温州 325000；2.温州市药检所，浙江 温州 325000)

目的 优选止咳口服液的最佳提取工艺。方法 采用正交实验法以总黄酮、黄芩苷为评价指标，以提取时间、溶剂倍量、提取次数为考察因素，筛选出止咳口服液的最佳提取工艺参数。结果 止咳口服液的最佳提取工艺：提取时间为1 h，溶剂倍量为10倍，提取次数2次。结论 该提取工艺可行，试验结果准确可靠，可以为确定止咳口服液的提取工艺提供实验依据。

止咳口服液；提取工艺；正交试验；黄芩苷；总黄酮

止咳方来源于温州市中医院呼吸科专家刘刚主任经验方，该方由地骨皮、桑白皮、黄芩、木蝴蝶等组成，具有清肺化痰，利咽止咳的功能。该方在临床上主要以汤剂服用，临床疗效显著，具备良好的市场前景。但由于汤剂存在口感差，服用剂量大，久贮易霉变、酸败，携带不便等缺点[1-3]，为方便患者服用，将其制备为口服液。

药材提取工艺的优化，是口服液质量控制中的重要环节。黄芩苷和总黄酮为本方主要有效成分和有效部位，药理研究表明：黄芩苷具有抗菌、抗病毒等多种活性，总黄酮具有止咳祛痰的多种功效[7]。因此用于治疗咳嗽、痰多、咽痒等呼吸道疾病的市售药品及医院制剂，多将黄芩苷、总黄酮作为质量控制的重要指标[4-6]。本实验以黄芩苷和总黄酮综合评分为指标，应用L9(34)正交试验，选定提取时间(A)、溶剂倍数(B)、煎煮次数(C)作为考察因素，对该制剂的提取制备工艺进行研究。

1 材料与方法

1.1 药品与试剂 黄芩苷和芦丁对照品(均购自中国药品生物制品检定所，批号分别为：110715-200514、100080-200707)。甲醇(色谱纯，购自国药集团化学试剂有限公司)，水为自制的超纯水，其他试剂为分析纯。

1.2 仪器 UV-1800型紫外可见分光光度计(上海美普达仪器有限公司)；LC-20AT型高效液相色谱仪(日本Shimadzu公司)；SPD-10Avp紫外可见检测器(日本Shimadzu公司)。

1.3 方法

1.3.1 正交试验优选口服液提取最佳工艺：以预试验中单因素考察结果为参考依据，选择影响药材提取效果的提取时间 (A)、溶剂倍数(B)、煎煮次数(C)作为考察因素, 每个因素设置3个水平，以总黄酮和黄芩苷含量为评价指标，L9(34)正交试验因素水平表，见表1。

表1 正交因素设计表Tab.1 Table of orthogonal factor design

1.3.2 总黄酮含量测定：

① 对照品溶液的制备：精密称取芦丁对照品10 mg，置于50 mL容量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，制得每1 mL含0.2 mg芦丁对照品溶液。

② 供试品溶液的制备：称取水提浸膏0.2 g，置于50 mL容量瓶中，加甲醇25 mL，摇匀，超声30 s，用甲醇稀释至刻度，制得水提供试品溶液；

③ 供试品测定方法：精密量供试品溶液各3 mL，分别置于25 mL量瓶中，加5% NaNO2溶液1 mL，摇匀，静置6 min，再加人10% Al(NO3)3溶液1 mL，摇匀，继续静置6 min，加4%的NaOH溶液5 mL，用蒸馏水稀释至刻度，摇匀，静置15 min，于510 nm波长处测定吸光度。

1.3.3 标准曲线：按照“1.3.2”项下方法，分别精密吸取对照品溶液3、4.5、6、7.5、9、10 mL，分别置于25 mL量瓶中，加5% NaNO3溶液1 mL，摇匀，静置6 min，再加人10% Al(NO3)3溶液1 mL，摇匀，继续静置6 min，加4%的NaOH溶液5 mL，用蒸馏水稀释至刻度，摇匀，静置15 min，得浓度分别为24、36、48、60，72，80 μg/mL，于510 nm波长处测定吸光度。

1.3.4 精密度试验：按照“1.3.2”项下方法，精密吸取芦丁对照品溶液10 μL, 连续平行进样6次，测定各吸光度。

1.3.5 稳定性试验：取同一水提供试品溶液，分别于0、15、30、45、60、120 min进行测定。

1.3.6 重复性试验：精密称量同一水提供试品浸膏6份，同法制备供试品溶液，按照“1.3.3”项下方法，于510 nm波长处测定吸光度。

1.3.7 回收率试验：精密称量已知含量的供试品溶液6份，分别精密加入36 μg/mL芦丁对照品溶液2 mL，按照“1.3.2”项下，制备供试品溶液6份，进行测定，计算回收率。

1.4 黄芩苷含量测定

1.4.1 对照品溶液的制备：精密称取黄芩苷对照品2.20 mg置于10 mL容量瓶中，加甲醇溶解并定容，制得每1 mL含0.22 mg黄芩苷对照品溶液。

1.4.2 供试品溶液的制备：精密量取1 mL水提取液，放入蒸发皿中蒸干成浸膏，加入适量甲醇溶液溶解移置10 mL的容量瓶中，并用甲醇定容至10 mL，超声30 min，补足减失重量，溶液通过0.45 μm微孔滤膜滤过，即得黄芩苷供试品溶液。

1.4.3 阴性样品溶液的制备：按止咳方口服液最佳工艺，制备不含黄芩与木蝴蝶药材的阴性对照样品溶液。方法同“1.4.2”项下。

1.4.4 色谱条件与检测波长：Diamonsil C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)填充剂为十八烷基键合硅胶；流速：1.0 mL/min；进样量：10 μL；柱温为30 ℃；流动相：乙腈:0.1%磷酸水=25:75。

1.4.5 系统适应性试验：分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10 μL，注入液相色谱仪。测得黄芩苷对照品，止咳方供试品及其阴性对照溶液的色谱图。

1.4.6 标准曲线：按照“1.4.1”项下分别精密对照品溶液0.1、0.5、1、1.5、2、3 mL，分别置于10 mL量瓶中，加甲醇定容，摇匀，得到黄芩苷对照品稀释液。按照上述色谱条件进行测定，记录峰面积。

1.4.7 精密度试验：精密吸取“1.4.2”项下供试品溶液10 μL，连续进样5次，测定各组分的峰面积值(n=5)。

1.4.8 稳定性试验：取同一供试品溶液，分别于0、1、2、4、8、10、12、24 h进样测定。

1.4.9 重复性试验：精密量取同一批供试品溶液，按照上述方法平行制备6份，按照“1.4.4”项下色谱条件进行测定。

1.4.10 加样回收率试验：精密称量已知含量的供试溶液6份，精密吸取每份供试品溶液0.05 mL，分别精密加入同一溶度对照品溶液1 mL，按“1.4.2”项下方法制备得供试品溶液6份，进行测定，计算回收率。

1.5 止咳口服液中总黄酮和黄芩苷的含量测定 按照“1.4.2”项下制备供试品，在510 nm测定吸收度，计算总黄酮含量。按照“1.3.2”项下制备成供试品溶液，精密吸取20 μL注入液相色谱仪，按照“1.4.4”项下进行分析，每份样品平行测定3份，采用外标法计算黄芩苷含量。

2 结果

2.1 总黄酮含量测定

2.1.1 总黄酮标准曲线：以吸光度(Y)对其浓度(C)进行线性回归，得回归方程Y=0.0109C+0.036(r=0.999)，结果表明，芦丁在24～80 μg/mL范围内，线性关系均良好。

2.1.2 精密度试验：结果显示RSD小于0.50%，表明仪器精密度良好。

2.1.3 稳定性试验：结果显示RSD小于2.25%，表明供试品溶液在2 h内稳定性良好。

2.1.4 重复性试验：结果显示RSD小于0.81%，证明重复性良好。

2.1.5 回收率试验：平均加样回收率为101.23%，RSD为2.62%，表明本方法准确可靠。见表2。

表2 加样回收率试验结果(n=6)Tab.2 Results of sample recovery test(n=6)

2.2 黄芩苷含量测定

2.2.1色谱条件与检测波长：根据文献[3-5]结果，确定黄芩苷HPLC的检测波长为270 nm。

2.2.2 系统适应性试验：结果显示，在以上色谱条件下，各指标的色谱峰与相邻成分达到基线分离，阴性对照液中色谱峰对测定无干扰，见图1。

图1 HPLC色谱图(A.黄芩苷对照品；B.黄芩苷供试品；C.阴性对照品)Fig.1 HPLC chromatogram(A.Baicalin reference substance;B.Baicalin test samples;C.Negative reference substance)

2.2.3 标准曲线：分别黄芩苷的峰面积对其浓度进行线性回归，得回归方程式Y=31058X-41837，r=0.9999，线性范围为2.2～220.0 μg/mL结果表明，黄芩苷在该范围内线性关系均良好。

2.2.4 精密度试验：计算得黄芩苷的峰面积的RSD为0.25%，表明该HPLC方法仪器精密度良好。

2.2.5 稳定性试验：黄芩苷峰面积在24 h内RSD小于0.55%，表明供试品溶液在24h内稳定性良好。

2.2.6 重复性试验：黄芩苷RSD分别为0.46%，表明该方法重复性良好。

2.2.7 加样回收率试验：黄芩苷平均加样回收率为101.04%，RSD分别为2.85%，表明该方法准确可靠。见表3。

表3 加样回收率试验结果(n=6)Tab.3 Results of sample recovery test(n=6)

2.2.8 止咳口服液中总黄酮和黄芩苷的含量测定：按照正交实验L9(34)设计，以总黄酮的提取量为评价指标，极值BA3>A1、C2>C3>C1，见表5。以黄芩苷的提取量为评价指标，极值BC3>C1，见表6。由表5、6可知，B因素均无统计学意义。综上所述，结合实际生产，确定生产条件为A2B3C2，即提取时间为1 h，溶剂倍量为10倍，提取次数2次。

表4 止咳口服液中总黄酮和黄芩苷的含量(mg/g)Tab.4 Contents of total flavonoids and baicalin in the Zheke oral liquid(mg/g)

表5 总黄酮方差分析表Tab.5 Analysis of total flavone variance

表6 黄芩苷方差分析表Tab.6 Analysis of variance of baicalin

3 讨论

止咳方中黄芩、木蝴蝶、桑白皮均具有黄酮类成分，该类成分具有镇痛、抗炎、调节免疫、镇咳、祛痰和平喘等功效，是止咳方的主要有效成分之一。其中，黄芩苷是止咳方黄酮类成分中最主要的药效物质，具有抗菌、抗病毒等的多种作用。因此，通过测定黄芩苷、总黄酮的含量、能较准确地控制止咳口服液的质量[8-10]。

本研究采用正交试验法，以总黄酮和黄芩苷作为检测指标，考察复方止咳口服液的制备工艺。本试验得出，止咳口服液的最佳制备工艺为提取时间为1 h，溶剂倍量为10倍，提取次数2次。本研究不仅建立了复方止咳口服液的制备工艺，同时也建立了口服液中多组分含量测定方法，既符合中药复方多靶点，多组分的特点，也为复方口服液的质量控制提供了内控依据。

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(编校：王冬梅)

Study on extraction technology of Zhike oral liquid

ZHU Xue-mei1, WANG Xiao-fen1, CHEN Yong-cai1, LIU Gang1, CHEN Ling-yun2

(1.Wenzhou Hospital of TCM, Wenzhou 325000, China; 2.Wenzhou Institute of Drug Control, Wenzhou 325000, China)

ObjectiveTo establish the best extraction technology of Zhike oral liquid. MethodsUsing orthogonal experiment method, total flavonoids and baicalin as evaluation index, extraction time, solvent times, extraction times as factors, the optimal extraction process parameters were selected. ResultsThe best extraction process of Zhike oral liquid: extraction time was 1h, solvent amount was 10 times, 2 times of extraction. ConclusionThe extraction process is feasible, the test result is accurate and reliable, which can provide the experimental basis for the extraction process of Zheke oral liquid.

Zhike oral liquid; extraction technology; orthogonal design; baicalin; total flavonoids

温州市中医药科研课题(2014ZB018)；杭州市重大科技创新专项(No.20131813A23)

朱雪梅，女，本科，副主任中药师，研究方向：中药饮片质量控制,E-mail：zhuxuemei33@163.com。

TQ461

A

1005-1678(2015)06-0140-03