HPLC法比较不同产地白花蛇舌草中两种香豆素类成分的含量

于亮　吕青涛　黄祝刚　左琳　满其倩　容蓉　巩丽丽　蒋海强

[摘 要] 目的：比较不同产地白花蛇舌草中两种香豆素类成分东莨菪亭和耳草酮B的含量，为完善白花蛇舌草药材质量标准提供参考依据。方法：采用Agilent Eclipse SB-C18色谱柱（5 ?m，4.6 × 250 mm），以甲醇-0.05%甲酸水为流动相，梯度洗脱，流速1.0 mL·min-1，检测波长367 nm，柱温30 ℃。结果：东莨菪亭和耳草酮B分别在0.34 μg·mL-1 ～ 5.40 μg·mL-1和0.32 μg·mL-1 ～5.12 μg·mL-1范围内线性关系良好，溶液稳定性、重复性及加样回收率良好；江西产药材中两种香豆素类成分的含量明显高于湖北、安徽、广西其它三个产地的药材，而产自广西的药材含量最低且没有检出耳草酮B。结论：本方法简便，准确度高，可用于不同产地白花蛇舌草药材中东莨菪亭和耳草酮B含量的比较测定。

[关键词] 白花蛇舌草；东莨菪亭；耳草酮B；高效液相色谱法；含量测定

中图分类号：O657 文献标识码： A 文章编号：2095-5200（2015）03-085-03

白花蛇舌草（Hedyotis diffusa）为茜草科耳草属植物，具有清热、解毒、消肿、止痛之功效[1]，现主要用于抗癌治疗与研究[2]，含有黄酮类，三萜类，蒽醌类，环烯醚萜苷类，甾醇类，香豆素类，烷烃类等化学成分。其中含有的香豆素类成分东莨菪亭具有解热[3]、抑制PC3细胞增殖与诱导凋亡的作用[4]，其亦可通过影响胞内钙代谢产生血管舒张作用[5]。另一呋喃香豆素类成分耳草酮B对Hep G2细胞有较为明显的抑制作用[6]。

课题组在对白花蛇舌草氯仿部位进行抗子宫内膜癌活性研究时，通过活性筛选分离得到了东莨菪亭（scopoletin）和另一活性成分，此成分的1H-NMR，13C-NMR数据与文献[6]中数据一致，确定为耳草酮B（hedyotiscone B），为首次于白花蛇舌草中分离得到。

白花蛇舌草中东莨菪亭与耳草酮B的含量测定尚未见文献报道。为考察药材中两种成分的含量及其与抗癌作用的关系，本文建立了HPLC法测定白花蛇舌草中东莨菪亭和耳草酮B含量的方法，并对四产地白花蛇舌草药材中两种成分的含量进行了测定及对比，也为白花蛇舌草药材质量方法研究提供参考依据。

1 仪器与试药

Agilent高效液相色谱仪，Eclipse SB-C18色谱柱（5 ?m，4.6 × 250 mm）（安捷伦科技有限公司），AE240型电子天平（瑞士梅特勒公司），KQ5200DB数字超声清洗器（昆山超声仪器公司），甲醇为色谱纯（禹王化工公司），水为蒸馏水，其他试剂为分析纯。

对照品东莨菪亭（标准品批号：D-020-140728）由北京宝赛希望生物科技提供，对照品耳草酮B由本实验分离纯化，经HPLC检测，东莨菪亭和耳草酮B纯度均> 98%。白花蛇舌草药材购自漱玉平民药店、七星药店和康之源药店，经山东中医院大学药学院李峰教授鉴定为茜草科耳草属白花蛇舌草（H. diffusa Willd.）。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

Agilent Eclipse SB-C18色谱柱（5 ?m，4.6 × 250 mm）；流动相为甲醇–0.05%的甲酸水溶液梯度洗脱（0～15 min：甲醇比例30%～45%；15～16 min：甲醇比例45%～55%；16～30 min：甲醇比例55%）；流速1.0 mL·min-1；柱温30 ℃；检测波长为367 nm；进样量为20 μL。

2.2 对照品溶液的制备

精密称取东莨菪亭13.5 mg，用甲醇溶解并定容于10 mL容量瓶中，得东莨菪亭对照品母液（1.35mg·mL-1），取母液适量稀释成浓度为3.38×10-4

mg·mL-1，6.75×10-4 mg·mL-1，1.35×10-3 mg·mL-1，2.70×10-3 mg·mL-1，5.40×10-3 mg·mL-1的东莨菪亭对照品溶液，用于线性关系考察；精密称取耳草酮B 12.8 mg，同样步骤配得耳草酮B对照品母液（1.28mg·mL-1），进而稀释成浓度为3.20×10-4 mg·mL-1，6.40×10-4 mg·mL-1，1.28×10-3 mg·mL-1，2.56×10-3 mg·mL-1，5.12×10-3 mg·mL-1的耳草酮B对照品溶液用于线性关系考察。分别取两种母液适量混合并稀释得两种成分的混合对照品溶液，用于色谱峰定位。

2.3 供试品溶液的制备

不同产地白花蛇舌草分别经干燥粉碎后，精密称取约1.0 g，用40%乙醇于90℃回流提取两次（第一次加溶剂80 mL、提取1.5 h，第二次加溶剂50 mL、提取50 min），合并提取液经减压回收溶剂至干，所得干燥物用氯仿超声提取3次[7]，每次30 mL，提取5 min，合并提取液经减压至干后用甲醇溶解并定容至10 mL量瓶中，得供试品溶液。

2.4 方法学考察

2.4.1 线性关系的考察 取2.2项下的东莨菪亭和耳草酮B对照品溶液，按2.1项下的色谱条件进样，测绘东莨菪亭和耳草酮B的峰面积，以峰面积平均值为纵坐标（Y），浓度为横坐标（X）进行线性关系考察，东莨菪亭对照品溶液的线性方程和相关系数为y = 45848x +2.3895，R2 = 0.9990，即在3.38×10-4

mg·mL-1～ 5.40×10-3 mg·mL-1范围内线性关系良好；耳草酮B对照品溶液的线性方程和相关系数为y = 43882x - 1.8533，R2 = 0.9992，即在3.20×10-4 mg·mL-1～5.12×10-3 mg·mL-1范围内线性关系良好。取2.2项下的混合对照品溶液在相同色谱条件下进样，结果见图 1中A。

A 混合对照品

B 江西产批号为130301的供试品

图1 高效液相色谱图

1-东莨菪亭；2-耳草酮B

2.4.2 精密度试验 取2.3项下江西产批号为130301的供试品溶液，按2.1项下色谱条件，连续测定 6次，测得东莨菪亭和耳草酮B的峰面积，计算RSD分别为1.63%，1.41%。

2.4.3 稳定性试验 取2.3项下同一份供试品溶液，按2.1项下色谱条件，分别在0、2、4、8、12、24 h测定，结果表明供试品溶液在24 h内稳定。供试品溶液中东莨菪亭峰面积的RSD为1.8%，供试品溶液中耳草酮B峰面积的RSD为1.5%。

2.4.4 重复性试验 取同批号江西白花蛇舌草药材（批号130301）约1g，按2.3项下制备6份，按2.1项下色谱条件，测定东莨菪亭含量为0.0010%，RSD=2.0%；耳草酮B含量为0.0017%，RSD=1.7%，表明该方法重复性较好。

2.4.5 加样回收率试验 取同批号江西白花蛇舌草药材（批号130301）已知含量的供试品3份，每份约1 g，每份按10 mL、20 mL、30 mL 三个体积加入2.70×10-3 mg·mL-1的东莨菪亭对照品溶液和2.56×10-3 mg·mL-1的耳草酮B对照品溶液，按2.3项下方法制备成供试品溶液，测定含量，计算回收率，结果见表1。

2.5 含量测定

取2.3项下各产地供试品溶液，在2.1色谱条件下分别进样，测得东莨菪亭和耳草酮B含量，平行操作3次，结果见表2。

3 讨论

3.1 提取溶剂的选择

同一批药材提取时，曾用95%乙醇、70%乙醇、40%乙醇、纯水分别回流提取，发现70%乙醇、40%乙醇对两种香豆素类成分提取率最佳，但70%乙醇对耳草酮B提取率相对较少，故选择40%乙醇对药材提取测定。回流提取后再用氯仿超声提取，经HPLC检测，此法制备东莨菪亭和耳草酮B，两种香豆素类成分提取完全，且干扰少。

3.2 洗脱条件的选择

由于两目标组分极性相差较大，若使用等度洗脱，分析时间较长，且两目标色谱峰与杂质峰亦达不到很好分离，故流动相使用等度洗脱。梯度洗脱易造成重现性不佳，解决办法是延长进样前平衡时间，且每次采用相同的平衡时间，平衡时间为15min。

3.3 检测波长的选择

供试品中东莨菪亭与香豆酸出峰时间基本相同，香豆酸对东莨菪亭的检测造成干扰，通过比较光谱图发现香豆酸在367 nm 波长下无吸收，而东莨菪亭与耳草酮B在367nm均有较好吸收，故采用此波长作为检测波长，从而可消除香豆酸的干扰，实现对东莨菪亭和耳草酮B的同时测定。

3.4 实验结果的分析

四产地中产自江西的白花蛇舌草中东莨菪亭和耳草酮B含量均是最高，再次是湖北、安徽、广西，而产自广西的没有耳草酮B检出。提示在对白花蛇舌草提取分离分析两种目标成分时，宜选用江西产地的白花蛇舌草。

参 考 文 献

[1] 黄建荣，刘咏海，喻志标，等.白花蛇舌草化学成分和药理活性研究进展[J].中成药， 2005，27（11）：1329-1331.

[2] 王顺启，陈力，倪虹，等.白花蛇舌草对肝癌细胞SMMC-7721基因表达的影响[J].中药材， 2007，30（10）：1285-1289.

[3] 杨柯，曾春晖.莨菪亭解热作用机理实验研究[J].中国药物应用与检测，2006，3：24-27.

[4] 刘雪莉，张亮，付新录.莨菪亭对PC3细胞增殖和凋亡的影响[J].中国药理学报，2001， 22（10）：929-933.

[5] OLIVEIRA E J，ROMERO M A，SILVA M S，et al.Intracellular calcium mobilization as a target for the spasmolytic action of scopoletin.[J].Planta Med，2001，67（7）：605-8.

[6] Chen YH，Chang FR，Wu CC，etc. New cytotoxic 6-oxygenated 8，9-dihydrofurocoumarins， hedyotiscone A-C， from Hedyotis biflora[J]. Planta Med. 2006， 72（1）： 75-78.

[7] 高晓霞，宋擎，吴维明，等.高效液相色谱法测定打碗花根中莨菪亭含量[J].中国医院药学杂志，2008，28（5）：366-368.