基于super—BSA技术开发甜瓜含糖量和酸度性状的功能性分子标记

张红　吴海波　李寐华　熊韬　王广智　伊鸿平

摘 要： 为达到选育甜酸味品系、缩短育种周期、提高选择准确率的目的，本研究基于简化基因组测序（SLAF-seq）的选择性基因型鉴定和集群分离分析（Super-BAS），结合生物信息学方法，以‘风味4号甜瓜F2群体甜味、酸味、不甜不酸3个极端表型群体为试验材料，精细定位甜瓜含糖量、酸度性状相关基因并开发功能性标记。结果显示：（1）将甜瓜含糖量、酸度性状定位在双亲基因组；（2）获得1个含糖量性状相关候选基因，3个酸度性状相关候选基因；（3）针对候选基因开发出1个含糖量性状相关基因功能性分子标记SLAF18745-S01和3个酸度性状相关基因功能性分子标记SLAF36334-S02、SLAF50072-S03和SLAF31212-S04。本研究开发的功能性分子标记为甜瓜品质性状基因的分子标记辅助选择提供了重要的标记基础。

关键词： 甜瓜； 含糖量； 酸度； 精细定位； 功能分子标记

Abstract： SLAF-seq-based selective genotyping and bulked segregant analysis（Super-BSA），together with bioinformatic methods were performed in three extreme phenotypes populations（sweetness，acidity and neither sweet nor sour） from the F2 population of a flavorful melon（Cucumis melo L.） ‘Fengwei No. 4； fine mapping of its genes related to sugar content and acidity traits was achieved and functional markers were developed. Results showed that：（i） both sugar content and acidity traits were mapped in parental genome；（ii） one sugar content trait-related candidate gene and three acidity trait-related genes were obtained；（iii） one sugar content（SLAF18745-S01） and three acidity （SLAF36334-S02，SLAF50072-S03 and SLAF31212-S04）trait-related gene functional molecular markers were developed based on the candidate genes. In conclusion，the functional molecular markers developed in this study provide an important marker foundation for molecular marker-assisted selection of quantitative trait loci of melons，which can reduce breeding cycles and improve the accuracy of selection.

Key words： Melon； Sugar content； Acidity； Fine mapping； Functional molecular markers

甜瓜（Cucumis melo L.）屬葫芦科甜瓜属，是一种重要的园艺作物，我国甜瓜的种植面积和产量均居世界第一。甜瓜是一种高多态性物种，含有各种不同果实风味的基因型[1-3]。

大多数果实的风味由糖、有机酸及果实特征香气组成，糖含量是影响甜瓜果实品质的主要因子[4]，蔗糖是甜瓜果实成熟所积累的主要成分[5-7]。甜瓜栽培种果实有机酸含量很低，但甜瓜种（Cucumis melo）中存在高有机酸含量的遗传变异[8-11]。近年来，育成了具有独特酸甜味的甜瓜栽培种[12-14]。甜、酸等风味的变化是一个复杂的过程，受一系列相关基因的影响和调控[15]。定位甜瓜含糖量、酸度性状相关基因并开发功能性标记，为提高甜瓜果实品质性状选育效率及甜瓜分子育种提供思路。在现有甜瓜育种实践中，对含糖量、酸度等风味性状大多是通过表现型间接对基因型进行选择，致使育种周期长，效率低，制约着甜瓜品种改良的进程[16]。分子标记辅助选择，尤其是对与目标性状关联的功能性分子标记的选择可极大提高选择的效率，加速遗传改良[17-18]。

现有技术中，功能性分子标记作为与表型相关的由功能基因序列中功能性单核苷酸多态性位点（SNP）开发而成的分子标记[19]，其开发必须具备以下2个条件：（1）有确定功能的候选基因并已知等位基因的序列信息；（2）在多个材料中对目标性状进行调查，对目标基因进行序列分析，结合性状和基因序列信息进行基于连锁不平衡（LD）的关联分析[20]。功能基因定位是功能性分子标记发掘的基础，目前功能基因定位常用的方法有基于传统遗传图谱定位与集群分离分析法（BSA）。基于传统遗传图谱对甜瓜糖、酸性状进行了QTL定位[8，21-23]，但该方法的周期长、密度低、成本高；而集群分离分析法（BSA）可快速、有效寻找与目标基因紧密连锁的分子标记，但混池个数有限，一般不超过10个，关联分析假阳性几率大，标记密度低。近年来发展的选择性基因型鉴定和集群分离分析（Super BSA），利用SLAF-seq（Specific Location Amplified Fragments sequence，特定位置扩增片段测序）[24]，选择均匀分布在整个基因组、且避开重复序列区域的特异片段进行高深度测序，通过比较SNP标记的不同基因型在2个混池中出现频率的差异，确定与性状紧密相关的分子标记。Super BSA分子标记密度高，30～200个体的混池，保证了基因定位的功效和准确性。同时，由于SLAF标签中的多态性位点已经定位在基因组上，可以根据基因组的位置使用引物设计软件进行引物设计，开发功能标记。这些近几年发展起来的分子标记技术，通过分子标记辅助选择可以将传统的表型选择转变为直接选择基因型，具有重要的意义，但是至今未见开展甜瓜含糖量、酸度性状相关基因功能性分子标记方面的研究和报道。

1 材料与方法

1.1 材料

高糖甜瓜自交系‘寿星为母本、高新果味自交系‘新果味为父本进行杂交，得到杂种F1即‘风味4号；由杂种F1自花授粉获得F2代群体，对父母本、F1及每个F2代单株果实的含糖量、酸度利用PAL-1糖度测定仪（日本ATATO公司）、STARTER300便携式pH计[奥豪斯仪器（上海）有限公司]测量并结合品尝进行鉴定。

1.2 含糖量、酸度性状相关基因定位

通过CTAB法[25]提取每份材料的基因组DNA，将5株父本、5株母本及甜味、酸味、不甜不酸各50个单株的基因组DNA等量混合，形成5个混池。利用酶切预测软件SLAF_Predict（北京百迈客公司开发）分析甜瓜基因组，分别对5个混池基因组进行双酶切，混池中各个样品同一位点处的DNA片段序列经过PCR扩增、Illumina GA IIx（Illumina，San Diego，CA，USA）测序。Blat比对软件对测序reads进行聚类、Cap snp 软件检测单核苷酸多态性，获得多态性的SLAF标签[26]。

选择不甜不酸混池中a/b > 3或者b/B > 3的纯和标记对含糖量、酸度性状进行关联定位。分别计算群体ac（不甜不酸）与ab（含糖量）之间和ac（不甜不酸）与aa（酸度）之间来源于不同基因型的差异比值，得到差异标记。将与含糖量、酸度性状关联的差异标记通过blat软件比对，在双亲基因组上定位，注释标记物理位置所在的基因，获得与含糖量、酸度性状相关的功能基因，挑选出处于功能基因外显子的SLAF标签。

1.3 功能性分子标记的开发及稳定性检测

利用Primer Premier 5.0软件，对功能基因外显子的SLAF标签设计引物，对甜味、酸味、不甜不酸及酸甜味材料基因组DNA，进行PCR扩增，PCR体系25 μL，含100 ng·μL-1模板DNA 1 μL、10×buffer 2.5 μL、2.5 mmol·L-1 dNTP 2 μL、10 μmol·L-1正向和反向引物各1 μL、5 U·μL-1 DNA Taq 酶0.3 μL、ddH2O 17.2 μL。PCR反应程序为94 ℃预变性5 min；94 ℃变性50 s，45～60 ℃退火1 min，72 ℃延伸1.5 min，35个循环；72 ℃延伸10 min。用6% PAGE胶银染检测扩增产物。将只在母本、甜味及父本、酸味单株中有扩增产物，而在不甜不酸单株中没有扩增产物的标记分别作为含糖量、酸度性状功能性标记。

2 结果与分析

母本‘寿星味甜（TSS >12，pH>6），父本‘新果味味酸（TSS?8，pH ?5），F1‘风味4号酸甜味（TSS>12 ，pH?5），F2群体分离出4种类型，即甜味（TSS >12，pH>6）、酸味（TSS?8，pH ?5）、酸甜味（TSS >12，pH?5）和不甜不酸（TSS?8，pH>6）。采用Super-BSA技术，父本、母本及3个混池共获得12 438 270 reads。深度大于10x以上的基因型的SLAF标签 46 087个，整体平均深度达161.81x，多态性的SLAF 标签4 480个，分别得到与含糖量性状相关差异标记114个、酸度性状相关差异标记215个。其中，连续3个以上满足分离比例的标记所在的区域即为关联区域，得到6个含糖量性状相关候选区域，区域内共有13个差异标记，23个酸度性状相关候选区域，区域内共有48个差异标记。13个甜味性状差异标记中1个被定位在双亲基因组上、并处在功能基因的外显子中；48个酸度性状差异标记中3個定位在双亲基因组上并处在功能基因的外显子中（表1）。

对1个含糖量性状相关功能基因及3个酸度性状相关功能基因的SLAF标签的多态性序列，利用Primer Premier 5.0软件各设计引物1对，引物序列见表2，以父本、母本、甜味、酸味、不甜不酸味单株为材料，进行PCR扩增，以发展含糖量、酸度性状功能性标记。将只在母本、甜味及父本、酸味单株中有扩增产物，片段分别为249、66、283、274 bp，而在不甜不酸单株中没有扩增产物的标记分别作为含糖量、酸度性状功能性标记。结果成功发现了1个含糖量性状相关功能性分子标记SLAF18745-S01（图1），3个酸度性状相关基因功能性分子标记SLAF36334-S02（图2）、SLAF50072-S03（图3）和SLAF31212-S04（图4）。

进一步对F1、F2单株材料进行PCR扩增，验证获得的含糖量、酸度性状相关基因功能性分子标记的稳定性。含糖量性状相关基因功能性分子标记SLAF18745-S01在F1及F2中甜味、酸甜味材料中扩增出249 bp条带，而F2中不酸不甜、酸味材料中没有出现（图5）。酸度性状相关基因功能性分子标记SLAF36334-S02、SLAF50072-S03、SLAF31212-S04只是在F1及F2中酸味、酸甜味材料中扩增出66、283、274 bp条带，而F2中不甜不酸、甜味材料中没有出现（图6、图7、图8），说明4个功能性分子标记是稳定的。

3 讨 论

前人基于传统遗传图谱对甜瓜糖、酸性状进行了QTL定位[8，21-23]，但并未进行分子标记的开发。Super BAS是利用生物信息学、高通量测序技术，通过30～200个体较大规模的混池，10 000+SNP高密度扫描，获得覆盖全基因组的海量序列信息，从而保证了基因定位的功效和准确性。目前利用高通量测序结合集群分离分析法（BSA）已成功精细定位水稻真菌稻瘟病[27]、小麦高籽粒蛋白含量基因GPC-B1[28]。本研究利用Super BSA技术，通过对具有不同甜味、酸味性状亲本及极端子代DNA混池的全基因组DNA标记高密度扫描，精细定位甜瓜含糖量、酸度性状区域，开发出1个含糖量性状相关基因功能性分子标记SLAF18745-S01和3个酸度性状相关基因功能性分子标记SLAF36334-S02、SLAF50072-S03和SLAF31212-S04。

通过应用甜瓜果实甜味、酸味性状相关基因功能性分子标记，在不同世代间重复性好、操作简便，为甜瓜品质性状基因的分子标记辅助选择提供了重要的标记基础，可简便、快速的应用于育种实践，从而将传统的表型选择转变为直接选择基因型。对于甜瓜含糖量、酸度性状的改良和改善具有重要的应用价值和意义，也为分子育种、系统进化、种质资源鉴定中分子标记的筛选提供了一种重要的开发途径。

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