睡菜离体快繁技术的研究

赵 峰，胡若洋，杜思乐，石雪飞，李学东

（首都师范大学 生命科学学院，北京100048）

睡菜（MenyanthestrifoliataL．）又名螟菜、醉草，为龙胆科睡菜属多年沼生草本植物，根状茎匍匐粗大，初为绿色，老熟后转为褐色，三出复叶，小叶卵圆形，挺出水面，总状花序具多花，花白色，花冠背面常带粉色，上部内面具白色流苏状毛，蒴果球形，种子膨胀，圆形，花果期5～7月，在中国分布于东北、华北、云南、西藏及四川等地［1］。可片植于河流、湖泊、池塘浅水处，极具观赏价值（图版Ⅰ，A～G）。睡菜的栽培繁殖以分株繁殖为主，多在每年的3～5月进行，将根状茎分割，具3～4个芽眼分栽即可，也可播种繁殖［2］。其在湿地植被恢复和植物多样性重建等方面具有很好的应用前景。

在瑞典睡菜是用于治疗肾炎和急性肾功能衰竭的一种传统药物，并且对于坏血病及其它疾病也具有显著疗效［3－4］。通过将睡菜根茎提取物施加于100～120g大鼠后研究发现：睡菜可抑制血小板活化因子（PAF），从而防止急性肾功能衰竭［5－6］。研究表明，睡菜具有显著的免疫调节及抗炎作用，这可能与其体内复杂的免疫多糖组分［7－8］有关。其兼具抗肿瘤的生物活性，前苏联在1982年就已经有利用睡菜与五氟尿嘧啶制剂配合成功治疗25例胃癌晚期患者的相关报道［9］。同时，睡菜还具有清热利尿、健胃、安神的作用，并可作蔬菜，具有很高的药用价值及广阔的应用开发前景。

对于睡菜的组织培养研究国内外研究报道极少，2012年吴昌宇等［10］对其外植体消毒和愈伤组织诱导进行了初步研究报道。李文洁等［11］对产自云南的睡菜进行了离体培养与植物再生研究，但其消毒方法、培养基成分和激素配比都比较复杂。本研究旨在探索一种简便、快速的睡菜离体繁殖技术，为睡菜种苗的规模化生产提供技术支持。

1 材料和方法

1．1 材 料

实验材料采自北京延庆县野鸭湖自然保护区长势良好的睡菜植株，该材料于2007年在北京延庆县湿地资源普查时被发现，为北京新记录种［12］。

1．2 方 法

1．2．1 培养基配置 本实验选用的基本培养基为MS培养基，琼脂含量0．8%，蔗糖浓度3%，pH 5．8～6．0，在121℃、0．15 MPa条件下灭菌20min。

1．2．2 外植体消毒 取10cm 睡菜嫩茎段为外植体（以休眠期取材为宜，可显著减少污染几率），用自来水冲洗1～2h，去除叶和根。然后在超净工作台中用75%酒精浸泡30s，放入1g／L HgCl2中消毒10min。用无菌水冲洗5次，浸泡5min，将消毒的材料切成0．5cm 厚薄片。

1．2．3 愈伤组织诱导 配制5组不同激素浓度的培养基（表1），每组重复4瓶，每瓶中接种3块相同睡菜嫩茎，培养15d。培养条件为（20±2）℃，12 h／12h光照，光强1 000～2 000lx，相对湿度50%～70%。定期观察，统计愈伤组织诱导率。

愈伤组织诱导率＝诱导愈伤组织数／总接种数

1．2．4 愈伤组织继代培养 配制4种不同激素浓度的培养基（表2），每组重复4瓶，每瓶接种3块愈伤组织。培养条件为（20±2）℃，12h／12h光照，光强1 000～2 000lx，相对湿度50%～70%。定期观察，统计愈伤组织增长率。

愈伤组织增长率＝增长愈伤组织数／总接种数

1．2．5 芽的诱导 设计采用双因素实验，共26组激素浓度梯度（表3），筛选适宜诱导睡菜愈伤组织出芽的NAA 和6－BA 激素浓度。将培养的愈伤组织接种到出芽培养基上，每组重复4瓶，每处理重复3次。定期观察，统计愈伤组织出芽率。

愈伤组织出芽率＝出芽愈伤组织数／总接种数

1．2．6 诱导生根及移栽 筛选最适宜诱导睡菜愈伤组织出根的NAA 和6－BA 激素浓度。设计采用双因素实验，共设置26组激素浓度梯度（表4）。将带芽的再生小苗接种于不同激素配比的生根培养基上，每组重复4瓶，每个处理重复3次。定期观察，统计平均生根率（平均生根率＝生根小苗数／总接种数）。得到的完整再生植株移栽于底部覆有灭菌土壤的水槽中，定期观察其生长状况，统计成活率（成活率＝成活植株数／总移栽数）。

2 结果与分析

2．1 睡菜愈伤组织诱导及继代培养

将消毒后的睡菜嫩茎段接种至培养基上（图版Ⅱ，A）。培养基中不加激素时，睡菜不能形成愈伤组织。当激素浓度在0．5～1．5mg／L 6－BA、0．05～0．15mg／L NAA 时，可形成浅绿色的愈伤组织（图版Ⅱ，B）。当培养基中激素含量为1．0mg／L 6－BA和0．1 mg／L NAA 时，睡菜愈伤组织诱导效果最好，达到100%（表1）。由此推断，最适宜的外植体诱导培养基为MS＋1 mg／L 6－BA＋0．1 mg／L NAA。

在外植体诱导出愈伤组织后，需要及时进行继代培养，以避免培养过程中微生物通过封口膜污染及培养基营养消耗引起的愈伤组织老化死亡。在继代培养中，仍然选择不同浓度6－BA 和NAA 来调控愈伤组织的生长。结果（表2）显示，睡菜愈伤组织在激素浓度范围为MS＋0．3～1．5mg／L 6－BA＋0．03～0．15 mg／L NAA 的培养基中均可进行增殖。其中在MS＋1mg／L 6－BA＋0．1mg／L NAA培养基中愈伤组织生长最好，愈伤组织生长率可达91．67%。

表1 不同激素配比对睡菜愈伤组织诱导的影响Table 1 Effect of different media on inducing calli of M．trifoliata

2．2 芽的诱导

由表3可知，在编号Y11～Y26的培养基中除其他均可诱导出芽且比较集中（图版Ⅱ，C～R）。

表3显示，在不同时期培养基Y18的诱导出芽率均出现最大值，推测睡菜最适诱导芽的培养基为编号Y18（图版Ⅱ，J）。重复接种和二次继代该培养基的出芽率均可达到50%以上，即最适芽诱导培养基是MS＋0．3mg／L NAA＋4mg／L 6－BA。

2．3 根的诱导及再生植株移栽

对根诱导需在出芽的基础上进行，当最初产生愈伤组织的时候，需使细胞分裂加快，即细胞分裂素／生长素（6－BA／NAA）的比值大时，更易诱导出芽。后期诱导生根形成完整再生植株的过程中，生长素起着更关键的作用。设计双因子实验，筛选最适宜诱导睡菜愈伤组织生根的NAA 和6－BA 浓度。

表2 不同激素配比对睡菜愈伤组织生长的影响Table 2 Effect of different media on inducing calli of M．trifoliata

表3 不同水平NAA和6－BA对睡菜芽的诱导Table 3 Effect of different mediums（NAA／6－BA）on inducing buds of M．trifoliata

表4 不同水平NAA和6－BA对睡菜根的诱导Table 4 Effect of different mediums（NAA／6－BA）on taking roots of M．trifoliata

表5 温度、光照强度对睡菜移栽苗的影响Table 5 The influence of temperature and light intensity on transplants

将生长情况良好的带芽愈伤组织接入不同激素浓度的培养基（表4）中，结果发现编号G12和G13培养基内愈伤组织在1周内均诱导出根，并且生根率很高（图版Ⅱ，S～V）。尤其G12培养基重复接种后可达100%的出根率（表4），说明最适宜诱导根的培养基是MS＋1 mg／L NAA＋0．3 mg／L 6－BA。形成的再生植株可选潮湿的雨天移栽于室外水池中，1周左右即可挺出水面（图版Ⅱ，X）。

获得睡菜完整再生植株移栽至不同温度、照度的培养箱中，观察不同培养条件对睡菜生长的影响。以移栽后20d为标准测量不同培养条件下睡菜的挺水高度，计算生长速率（生长速率＝挺水高度／生长时间）。结果（表5）发现光照强度及培养温度对睡菜的生长均有影响，低温、弱光条件下睡菜的生长受到明显抑制，其中温度对睡菜的生长影响较为明显。睡菜的培养要求温度较高，因此初夏移栽应为最宜。

3 讨 论

睡菜作为一种水生植物，其外植体的消毒是一个难题，其中外植体的取材时间是首先要考虑的因素［13］。从入秋到春季萌芽前的休眠期取材，再把睡菜嫩茎段用1g／L 的多菌灵悬浊液浸泡24h，可大大降低其染菌的概率。

诱导芽的培养基配制时，总会出现培养基没有凝结的情况。经反复配制发现，激素的浓度很容易影响培养基的酸碱度。高浓度的6－BA 使培养基过于偏酸，致使培养基不易凝结。因此配制前将6－BA浓度高于6mg／L的培养基pH 提前调至6．3，这样所制作的培养基更易凝结。

再生小苗的室外移栽由于易受外源微生物和原生动物的侵染，致使其成活率仅有30%左右。延长睡菜在无菌瓶中的生长期可以达到壮苗的目的，并有利于提高移栽的成活率［14］。将利用植物组织快繁技术得到的再生小苗转移到经高压蒸汽灭菌（121℃／30min）的土及蒸馏水中先培养1周。壮苗后的睡菜再移栽于室外可达100%的成活率。睡菜耐寒而不耐旱，培养过程中要及时补水，防止由于水分蒸发造成的缺水胁迫。

睡菜作为少有的湿地观花植物具有很高的观赏价值和药用价值，利用植物离体快繁技术，通过改变MS培养基中6－BA、NAA 的浓度，建立睡菜组织培养无性系，30d左右便可得到大量的再生苗，有利于睡菜的进一步推广和普及。

图版Ⅰ 睡菜自然景观及再生植株炼苗实验PlateⅠ The natural landscape and hardening experiments of M．trifoliata

图版Ⅱ 睡菜组织培养过程PlateⅡ The process of tissue culture on M．trifoliata

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