Chk1/chk2在Aβ致伤海马神经元中的表达及意义①

黄昕艳，尉荣翠，杨 智，李 壮，刘 爽

(1．佳木斯大学附属第二医院神经内科，黑龙江 佳木斯 154002；2．佳木斯大学附属第一医院肿瘤科，黑龙江 佳木斯 154003；3．佳木斯大学遗传教研室，黑龙江 佳木斯 154002)

Chk1/chk2在Aβ致伤海马神经元中的表达及意义①

黄昕艳1，尉荣翠1，杨 智1，李 壮2，刘 爽3

(1．佳木斯大学附属第二医院神经内科，黑龙江 佳木斯 154002；2．佳木斯大学附属第一医院肿瘤科，黑龙江 佳木斯 154003；3．佳木斯大学遗传教研室，黑龙江 佳木斯 154002)

目的：探讨Chk1/chk2在Aβ致伤海马神经元中的表达及意义。方法：应用新生(3d以内)SD大鼠采用急性分离、胰酶消化的方法培养海马神经细胞，分别于Aβ25-35致伤0h、8h、16h、24h，并采用免疫细胞染色观察各时间点Chk1/chk2表达情况。结果：体外培养的神经细胞生长状态良好，免疫细胞染色鉴定结果表明Chk1、chk2蛋白在Aβ致伤神经元后，随致伤时间延长均有表达，且以chk1表达显著，在致伤16h有差异明显(P<0.05)。结论：Chk1/chk2共同参与了在Aβ致伤海马神经元中的DNA损伤修复，以chk1表达更显著，提示可望为AD中神经元的DNA损伤修复提供新的干预点。

海马神经元；Chk1/chk2；Aβ

近年来的研究指出，细胞周期的异常可能是AD发生的较早期事件，这种异常的细胞周期可导致细胞的凋亡，最终引发AD。成熟神经元再进入细胞周期与DNA损伤有关，在DNA损伤修复过程中不可回避的涉及到细胞周期检测点激酶Chk1和(或)Chk2的活化[1]，而Chk1和(或)Chk2在Aβ致伤神经元中的激活情况尚未见报道，故本研究以Aβ致伤神经元为AD的细胞模型，探讨Chk1和Chk2在Aβ致伤神经元的表达差异，为AD中神经元的DNA损伤修复提供全新的干预点。

1 材料与方法

1.1 材料

新生SD大鼠(1～3d)，由佳木斯大学实验动物中心提供(动物质量合格证号：黑动字第99102001)。药物及试剂 DMEM/F12干粉培养基、B27、胎牛血清均购自美国Sigma公司，Aβ25-35购自北京博奥森生物技术有限公司，兔抗大鼠单克隆神经元特异性烯醇化酶(neuron specific enolase,NSE)单克隆抗体、SABC即用型试剂盒、DAB显色试剂盒购于Boster公司。

1.2 方法

1.2.1 海马神经元的原代培养[2]

选用出生3d内的SD大鼠，解剖分离出海马，经0.125%胰酶消化8～12min，用含有10%胎牛血清的DMEM/F12种植液终止消化。经悬浮、离心、过滤等步骤收集细胞，用种植液制成密度为5×105个/mL的单细胞悬液，接种于预先铺有多聚赖氨酸的6孔培养板内，置于37℃，5%CO2培养箱中培养。24h后换含2%B27的DMEM/F12培养基，每隔3d半量换液1次。

1.2.2 原代神经元鉴定[3，4]

NSE免疫细胞化学鉴定：培养至第7d的神经细胞，以PBS轻洗3遍，4%多聚甲醛固定30min后，PBS洗2次。0.4% TritonX-100破膜20min，PBS洗3遍，山羊封闭血清封闭30min，滴加NSE(1：200稀释) 一抗，4℃湿盒内孵育过夜。次日加二抗室温避光孵育50min，加新鲜配制的DAB溶液显色，光镜观察。

1.2.3 Aβ25-35致伤及实验分组

海马神经元培养7d后，弃原培养液，加入DMEM培养液及终浓度为10μmol/L的Aβ25-35(前期实验筛选的最佳致伤浓度)孵育，Aβ25-35肽分别孵育0h、8h、16h、24h终止培养，分别以chk1、chk2为一抗，进行免疫细胞化学染色。每组6孔，每张盖玻片上随机选取6个视野，高倍镜下综合染色强度和阳性细胞所占比例进行半定量测定。染色强度评分标准：不着色0分；黄色1分；棕黄色2分；黄褐色3分。阳性细胞所占比例评分标准：阳性细胞数<10%者0分；10%～40%者1分；40%～70%者2分；>70%者3分。两种评分相乘，结果记为免疫化学评分值，以均数±标准差表示。

1.3 统计学方法

采用SPSS13.0统计软件包进行统计分析，以P<0.05作为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 神经元形态学观察及鉴定

接种后的海马神经细胞呈圆形，单个均匀分布，2h后开始贴壁，培养24h后细胞大部贴壁且部分已长出突起，随养时间延长，突起逐渐增多、延长并交织成网。培养至7d细胞生长成熟，见图1。NSE免疫染色显示90%以上的培养细胞为阳性染色，符合细胞原代培养纯度要求，见图2。

图1 7d，神经细胞原代培养7d(×200)

图2 7d，NSE免疫细胞染色(DAB显色)

2.2 Chk1、Chk2蛋白在Aβ致伤神经元中的表达

Chk1、chk2蛋白在Aβ致伤神经元后，随致伤时间延长均有表达，阳性细胞表达定位在细胞核及细胞质，并以细胞核为主。 Chk1与chk2蛋白表达在0h、8h无显著差异，在致伤16h及24h， Chk1与chk2蛋白表达水平明显高于对照组(P<0.05)，且chk1与chk2表达有显著性差异(P<0.05)，见表1。

表1 chk1、chk2蛋白在Aβ致伤神经元中的表达(免疫化学积分)

注：*与正常对照组比较，P<0.05；△与chk2蛋白表达比较P<0.05。

3 讨论

Aβ可通过多种途径产生神经毒性作用，近年来提出了AD发病过程中大量神经细胞凋亡机制的假说-细胞周期假说。CHK1、CHK2是细胞周期检查点蛋白，在DNA损伤所致的周期阻滞中起到重要作用，其不仅能够引起细胞周期阻滞，而且还直接或间接参与了DNA损伤的修复过程[5]。

在本研究中，通过免疫细胞化学观察，Aβ肽致伤神经细胞的8h、16h、24h均可看到CHK1、CHK2的蛋白表达，在Aβ肽致伤16h时CHK1、CHK2表达显著，同时可以看到CHK1、CHK2相比较，CHK1的表达更明显，CHK1和CHK2功能上的相互重叠增强了损伤细胞的自我保护能力。

DNA受损后，可触发一系列的级联效应，DNA修复蛋白复杂多样，作为DNA损伤修复的关卡反应蛋白，有研究报道CHK1或CHK2的高表达可以提高DNA修复效率，改变细胞凋亡的命运[6]。

目前，CHK抑制剂在阻止细胞周期停滞、抑制DNA修复，诱导DNA损伤细胞凋亡方面的研究受到广泛关注[7，8]，大量结果表明CHK抑制剂在抑制DNA修复的治疗中越来越显现出其优势[9]，这些问题的解决对于挽救AD中大批损伤神经元的命运至关重要。而随着细胞周期检验点和DNA修复机制研究的深入，针对性的选择周期检验点或DNA修复通路中的关键蛋白，已成为近年来干预细胞周期治疗的新靶点。

[1]Wang WJ,Wu SP,Liu JB,et al.MYC regulation of CHK1and CHK2 promotes radioresistance in a stem cell-like population of nasopharyngeal carcinoma cells[J].Cancer Res,2013，73(3):1219-1231

[2]王廷华，冯忠堂.神经细胞培养理论与技术[M]．北京：科学出版社，2005，83-84

[3]黄昕艳,赵锦程,尉荣翠,等. Aβ_(25-35)寡聚体对大鼠海马神经细胞的活性影响及形态学观察[J].中风与神经疾病杂志，2013，30(3)：218-221

[4]胡旭慧，黄昕艳，朱晓峰. Aβ_(25～35)寡聚体对原代培养海马神经元突触的损伤作用[J].黑龙江医药科学，2010，33(3)：113

[5]冯旭，黄昕艳，江清林，等. BDNF对Aβ致伤大鼠海马神经元突触功能修复的影响[J]. 黑龙江医药科学，2013，36(6)：7-10

[6]Karnitz LM，Flatten K S，Wagner J M，et al.Gemcitabine-induced Activation of checkpoint signaling pathways that affect tumor cell survival[J]. Mol Pharmacol,2005,68:1636-1644

[7]Ashwell S，Zabludoff S. DNA damage detection and repair pathways—recent advances with inhibitors of checkpoint kinases in cancer therapy[J]. Clin Cancer Res，2008,14:4032-4037

[8]Helleday T，Petermann E，Lundin C，et al.DNA repair Pathways as targets for cancer therapy[J]. Nat Rev Cancer，2008,8:193-204

[9]Mukhopadhyay U K，Senderowicz A M，Ferbeyre G. RNA silencing of Checkpoint regulators sensitizes P53-defective prostate cancer cells to Chemotherapy while sparing normal cells[J].Cancer Res，2005,65:2872-2881

黑龙江省教育厅课题，编号：12521570和12521543。

黄昕艳(1969～)女，黑龙江佳木斯人，学士，主任医师。

刘爽(1975～)女，黑龙江佳木斯人，博士，教授。E-mail:lockandkey@sina.com。

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1008-0104(2015)01-0072-02

2014-08-12)