老年性白内障和糖尿病性白内障晶状体上皮细胞的超微结构改变及凋亡相关基因的表达

金子夜，王心淼，郜青叶，闫莉丽，王英洲

(内蒙古医科大学附属人民医院眼科,呼和浩特 010010)

·论著·

老年性白内障和糖尿病性白内障晶状体上皮细胞的超微结构改变及凋亡相关基因的表达

金子夜，王心淼，郜青叶，闫莉丽，王英洲

(内蒙古医科大学附属人民医院眼科,呼和浩特 010010)

目的 研究晶状体上皮细胞凋亡对白内障发展所起的作用。方法 收集老年性及糖尿病性白内障晶状体前囊膜送电镜扫描，取老年性及糖尿病性白内障晶状体前囊膜各5例，用反转录酶-聚合酶链锁反应(RT-PCR)检测法，检测凋亡相关基因的表达。结果 老年性白内障晶状体上皮细胞形态大小不一,多扁平细胞，细胞间隙增大,胞浆内可见空泡变性,部分细胞溶解坏死,部分细胞皱缩,呈早期细胞调亡改变；糖尿病性白内障晶状体上皮细胞的胞浆空泡变性更加严重，两种白内障晶状体上皮细胞中均可见凋亡细胞。糖尿病患者白内障晶状体前囊膜样本中Fas、p53与Bax基因的表达显著高于老年性患者。结论 老年性和糖尿病性白内障的发生与晶状体上皮细胞的凋亡密切相关。

白内障; 晶体;上皮细胞; 细胞凋亡

白内障是一种常见的致盲眼病，对于其发病机制，有研究[1-3]发现外线、过氧化氢和钙离子均可诱发晶状体上皮细胞(LEC)凋亡，认为晶状体上皮细胞凋亡是非先天性白内障共同的细胞学基础。Fas、Bax和P53基因是调控细胞凋亡的重要因子。本研究对15例老年性白内障和15例糖尿病性白内障患者的晶状体前囊膜进行了细胞凋亡特征的检测，通过反转录酶-聚合酶链锁反应(RT-PCR)检测法对调控细胞凋亡的基因Fas、Bax和P53在老年性和糖尿病性白内障晶状体上皮细胞中的表达差异进行检测，并对两种白内障的晶状体上皮细胞的超微结构进行了观察，旨在探讨老年性白内障和糖尿病性白内障的发生与细胞凋亡的关系及两者间凋亡相关基因的表达差异。

1 材料和方法

1.1 标本收集 从2012年至2014年在我院眼科住院并进行白内障超声乳化摘除术的60～80岁老年性白内障和糖尿病性白内障患者中各随机挑选出15例15眼，白内障组平均年龄为(67.3±5.7)岁，其中男9例,女6例；糖尿病组平均年龄为(63.3±4.2)岁，其中男8例女7例。在手术中用撕囊镊撕取直径约为6 mm的晶状体前囊膜并进行保存。两组中各随机取10例进行晶状体上皮细胞的电镜观察，各取5例进行RT-PCR检测相关凋亡基因。

1.2 主要仪器 AEM-1200 型透射电子显微镜；涡旋振荡仪QL-902，海门市其林贝尔仪器制造有限公司；离心机Centrifuge 5415D，Eppendorf；分光光度计NANODROP 2000，Therno scientific；荧光定量PCR仪ABI7500，Applied Biosystems。

1.3 主要试剂 TRNzol总RNA提取试剂，天根生化科技(北京)有限公司；PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser，TaKaRa(宝生物)；SYBR® Premix Ex TaqTMII (Tli RNaseH Plus)，ROX plus，TaKaRa(宝生物)；DL2,000 DNA Marker，TaKaRa(宝生物)；引物合成，Invitrogen。

1.4 实验方法

1.4.1 电镜 手术显微镜下用撕囊镊撕取直径约6 mm 的晶状体前囊膜。用0.9%氯化钠溶液冲洗后使用2.5%戊二醛在4 ℃冰箱中固定2 h以上，再使用0.1 M磷酸盐缓冲液冲洗3次，1%锇酸固定1 h左右，再用0.1 M磷酸盐缓冲液冲洗3次，用乙醇进行梯度脱水，环氧树脂包埋，超薄切片后经饱和醋酸铀染色30 min，柠檬酸铅染色8 min，采用透射电镜观察其超微结构并照相。

1.4.2 RT-PCR (1)采用TRNzol总RNA提取试剂进行样本RNA提取，把组织放入已预冷的研钵中进行研磨,待组织样本成粉末状后，加入Trizol，加氯仿0.2 mL，离心后吸取上层水相(吸70%)到另一新离心管管中，加入等体积的-20 ℃预冷异丙醇,充分颠倒混匀，置于冰上10 min；按1 mL/mL Trizol的比例加入75%DEPC乙醇悬浮沉淀 (4 ℃保存)，高速离心5 min；弃去乙醇液体，室温下放置5 min以充分晾干沉淀,加入DEPC处理过的水溶解沉淀； 采用Nanodrop2000紫外分光光度计测量RNA纯度及浓度,冻存于-80 ℃。(2)采用PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser进行cDNA反转录，去除基因组DNA反应，取随机引物5×gDNA Eraser Buffer2.0 μL、gDNA Eraser 1.0μL和RNase Free H2O Up to 10μL于42℃孵育2 min。再将上一步骤的反应液 10.0μL、PrimeScript RT Enzyme MixⅠ 1.0μL、RT Primer Mix 1.0μL、5×PrimeScript Buffer 2 4.0 μL、RNase Free H2O 4.0 μL 37 ℃孵育15 min，85 ℃ 5 s，cDNA保存放-20 ℃冰箱备用。(3)用ABI 7500型荧光定量PCR仪，采用2-△△CT法进行数据的相对定量分析。用SYBR® Premix Ex TaqTMII (Tli RNaseH Plus), ROX plus进行扩增，引物筛选：将各样本cDNA混合后，以此为模板进行5倍梯度稀释，稀释后样品各取2μL作模板，分别用目的基因引物和内参基因引物进行扩增。

2 结果

2.1 实验结果

2.1.1 电镜结果 老年性白内障组：老年性白内障晶状体上皮细胞形态大小不一,细胞排列紊乱，大多呈扁平状,扁平状细胞细胞核是椭圆形或不规则形,核缩小,核内染色质不均匀,边聚或者浓缩。核膜皱折,核周间隙增宽。内质网空泡变性,胞浆有浓缩。

糖尿病性白内障组：糖尿病性白内障晶状体上皮细胞大多呈扁平状,细胞核、细胞膜的变化与老年性白内障患者基本相同。胞质内很少有细胞器,胞质大部分呈内质网空泡变性,空泡变性比老年性白内障患者严重,胞质也有浓缩。

2.1.2 RT-PCR结果

2.1.2.1 RNA电泳图 取5 μL RNA，用1%琼脂糖凝胶进行电泳, 见图1。

2.1.2.2 各样品相对定量分析结果 根据RealTimePCR原始检测结果，按照2-△△ct相对定量计算公式，即

2.2 各样品的目的基因相对定量结果 即其他各个样品相对于对照样品，目的基因mRNA转录水平的差异。由表1可见，糖尿病患者白内障晶状体前囊膜样本中Fas、p53与Bax基因的表达显著高于老年性患者，由于个体差异原因，在同一种疾病的患者群体里，Fas、p53与Bax基因分别表达的量并不一致，但从群体角度分析，糖尿病患者的表达量显著高于老年性患者。

3 讨论

晶状体上皮细胞凋亡与白内障发生的关系已引起人们关注[2]。有研究[4]比较了年龄相关性白内障和糖尿病性白内障晶状体上皮细胞的凋亡情况，免疫组织化学及RT-PCR表明糖尿病组比白内障组Fas及其mRNA 的表达增高，说明凋亡在白内障中发挥重要的作用, 并且可能是通过Fas介导的途径。 P53是一种典型的抑癌基因，是重要的肿瘤抑制基因，能促进细胞凋亡,通过bax/bcl2, Fas/Apol，IGF-BP3 等蛋白，p53可完成对细胞凋亡的调控作用。Bel-2是一个家族基因，bel-2、bel-XL、bax和bel-XS是该家族的重要成员，它们主要通过线粒体途径参与凋亡调控Bcl-2可阻止凋亡形成因子如细胞色素C等从线粒体释放出来，具有抗凋亡作用，而Bax可与线粒体上的电压依赖性离子通道相互作用，介导细胞色素C 的释放，具有凋亡作用，p53可以上调Bax的表达水平并下调Bcl-2的表达，从而完成促进细胞凋亡作用。国内已有文献报道[5-7]，老年性白内障患者晶状体上皮细胞Bax基因蛋白表达呈阳性，而健康成年人晶状体上皮细胞几乎未见Bax基因蛋白的表达。这提示我们，白内障的发生与晶状体上皮细胞的凋亡关系密切，而Bax在高表达又与白内障晶状体上皮细胞凋亡有着密切的关系。

表1 Real Time PCR检测相对定量结果

注：以糖1 样本为对照样本

在本研究中，老年性及糖尿病性白内障的超微结构进行观察，结果显示晶状体上皮细胞内可见空泡变性，部分细胞的细胞器肿胀，细胞皱缩，细胞核中染色质固缩周边化，呈早期凋亡改变，糖尿病性白内障晶状体上皮细胞中的空泡变性较老年性白内障患者严重，胞质也有浓缩。通过RT-PCR进行检测，结果显示，在糖尿病性白内障组晶状体上皮细胞中的Fas、Bax和P53的表达比老年性白内障组高，说明糖尿病患者白内障晶状体前囊膜的细胞凋亡程度相比老年性患者更加严重。

(本文图1见插图5-1)

[1] 何小杰,李延辉,徐飞，等.老年性白内障晶状体上皮细胞凋亡及Fas、FasL表达的临床意义[J].中国医药科学,2013,3(3):39-40,54.

[2] 李彬,阚红卫,武汪洋，等.老年大鼠角膜和晶状体上皮细胞NADPH氧化酶表达的研究[J].安徽医药,2012,16(10):1425-1427.

[3] 胡红莉,尹莉莉,管怀进，等.白内障患者晶状体上皮细胞中Fas蛋白的表达[J].国际眼科杂志,2008,8(2):252-254.

[4] 尹莉莉,管怀进,胡红莉，等.白内障手术摘出前囊下晶状体上皮细胞中β1整联蛋白、Fas蛋白的表达[J].眼外伤职业眼病杂志,2008,30(12):918-922.

[5] 黄秀榕,祁明信,汪朝阳，等.复方水蛭滴眼液抑制大鼠晶状体上皮细胞凋亡及其对Bcl-2和Bax基因的调控[J].中西医结合学报,2007,5(6):681-685.

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Expression of apoptosis related factors and ultrastruetural changes in the lens epithelial cells of senile and diabetic cataract

JinZiye,WangXinmiao,GaoQingye，YanLili，WangYinzhou

(DepartmentofOphthalmology，theAffiliatedPeople′sHospitalofInnerMongoliaMedicalCollege，Huhhot010010，China)

WangXinmiao,Email:1977king@163.com

Objective To study the effect of lens epithelial cell apoptosis in cataract development.Methods Five cases anterior lens capsules of senile and diabetic cataract respectively were collected.Transmission electron microscope was used to observe the anterior lens capsules.The apoptosis-related genes were detected by Reverse Transcriptase - Polymerase Chain Reaction. Results The epithelial cell of senile cataract lens differed in size, usually as flat epithelial cells, intercellular space dilatation, vacuoles degeneration can be seen in the cytoplasm,dissolve putrescence of part cytolysis necrosis,show the change of early cell apoptosis.The vacuoles degeneration of cytoplasm in diabetic cataract was more serious than senile.The apoptotic cell were seen in two cataract lens.The expression of Fas,p53 and Bax of diabetic cataract were higher than those in senile.Conclusions Epithelial cell apoptosis is closely related to the development of senile and diabetic cataract.

Cataract; Lens,crystalline;Epithelial cells;Apoptosis

内蒙古科技厅基金资助(20110501)

金子夜，医师，Email: jinziye1987@126.com

王心淼，主治医师， Email：1977king@163.com

R776.1

A

10.3969/J.issn.1672-6790.2015.05.011

2015-06-10)

ExpressionofapoptosisrelatedfactorsandultrastrueturalchangesinthelensepithelialcellsofsenileanddiabeticcataractJinZiye,WangXinmiao,GaoQingye，YanLili，WangYinzhou