老年高血压患者唾液微生物群落初步研究

程 倩 吴红崑

原发性高血压(Primary Hypertension)是老年人较常见的心血管疾病，由于年龄增长、饮食结构和生活环境的改变，老年群体中的高血压患病率不断增高。慢性牙周炎(chronic periodontitis)是以菌斑微生物为始动因子，发生在牙周支持组织的慢性感染性疾病。研究结果表明[1]：调整了性别、年龄、糖尿病、吸烟指数、体重指数和血胆固醇含量等因素后，多因素分析结果显示：牙周病与心血管疾病发病率呈正相关，牙周病是心血管疾病的独立危险因子。目前，对于动脉粥样硬化和冠心病与牙周炎的关系，国内外关注较多，但有关高血压与牙周炎的研究较少，有待进一步深入研究。口腔生态系统是一个由大量微生物组成的复杂庞大的生态系统，在700 多种可检出的口腔细菌中，只有不到50%的细菌可以在体外培养[2]。区别于传统培养方法， 以PCR 为基础的高通量方法如变性梯度凝胶电泳(denaturing gradient gel electrophoresis，DGGE)，可以不必对原始样本进行培养而直接提取基因组DNA，分析细菌群体在基因水平和代谢水平上的多样性，监测微生物群落的动态变化，以及发现新的口腔微生物物种等[3]。本研究通过PCR-DGGE 技术初步分析不同牙周状况的老年高血压人群唾液微生物多样性变化，比较其微生物群落结构差异。

1. 材料和方法

1.1 纳入标准

1.1.1 总纳入标准 65-80 岁，身体、精神发育正常，剩余牙数不少于18 颗，无长烤瓷桥修复；至少3 个月内未服用抗生素及免疫抑制剂，6个月内未接受任何牙周治疗；除牙周炎外无其他明显口腔感染性疾病，除单纯原发性高血压外无其他系统性疾病。

1.1.2 牙周炎患者纳入标准[4]临床诊断为慢性牙周炎；至少4 个位点牙周探诊深度(PPD)＞5mm；至少4 个位点临床附着丧失(CAL)＞3mm；至少4 个位点X 线片显示明显牙槽骨吸收。

1.1.3 高血压患者纳入标准[5]确诊为单纯原发性高血压：非同日在息静及非药物状态下，3 次测得血压平均值超过世界卫生组织统一标准，即收缩 压SBP ≥140mmHg 和/ 或 舒 张 压DBP ≥90mmHg；血压控制范围：( 140-180)/ (90-110)mmHg；排除继发性高血压患者；未并发糖尿病和其它心血管疾病。

1.2 样本采集 向受试者交代该实验的目的、过程、风险、收益及退出机制等，确保理解全部内容，待受试者签订知情同意书后取样。分为高血压伴慢性牙周炎患者(组HN+CP ，5 例)、全身健康慢性牙周炎患者(组CP ，5 例)、口腔健康高血压患者(组HN ，5 例)和健康对照(组N ，4 例)4 组。早8 时空腹自然口含唾液数分钟后，由同一名操作者将灭菌EP 管置于受检者下唇口腔黏膜，使唾液自然流入，收集4 组人群刷牙后12 小时非刺激性唾液样本3ml，冷藏，-80℃保存。

1.3 唾液细菌总DNA 提取 使用试剂盒MasterPureTM DNA Purification Kit (Epicentre Biotechnologies) 提取唾液样本中的细菌基因组DNA，-20℃储存。

1.4 PCR 扩增 使用DreamTaqTM PCR Master Mix 试剂盒对基因组DNA 进行扩增，扩增区域为16S rDNA 基因V3 区，得到目标片段约为300bp 的扩增产物。引物设计为不同种类细菌的扩增通用引物：上游引物5' CGC CCG CCG CGC CCC GCG CCC GTC CCG CCG CCC CCG CCC GAC TAC GTG CCA GCA GCC-3' ，下游引物5' -GGA CTA CCA GGG TAT CTA ATC C -3' 。1%普通琼脂糖凝胶电泳检测PCR 产物。

1.5 变性梯度凝胶电泳 PCR 扩增产物通过DCodeTM Universal Mutation 检测系统(Bio-Rad，Hercules， CA，USA)进行变性梯度凝胶电泳。变性剂梯度为40%-60%，电压恒定为60V，温度60℃电泳过夜，约16h 后，溴化已锭(EB)染色10min，漂洗10min，于胶成像系统中成像。

1.6 条带回收测序 切下凝胶上的特征条带，送北京六合华大基因科技股份有限公司克隆、测序。测序结果利用美国国立卫生研究院GenBank数据库Nucleotide blast 程序进行序列比对分析，找出其相似度最高的微生物种属。

1.7 DGGE 图谱分析 采用Quantity One 1-D 分析软件4.6.2(Bio-Rad 公司， 美国)对电泳图像进行分析。对DGGE 图谱进行优化处理后，识别、调整泳道及条带，进行条带配对，对图谱中的条带进行半定量分析。采用丰富度(S)和Shannon-Weaver 指数(H’)反应群落多样性。多样性数据使用SPSS13.0 软件包进行方差分析(ANOVA)。

2. 结果

2.1 DGGE 指纹图谱 DGGE 指纹图谱显示4 组样本唾液微生物群落组成丰富，组间条带结构存在多样性和差异性(图1)。

2.2 多样性分析 采用丰富度(S)和Shannon-Weaver 指数(H’)来分析4 组人群的多样性(表1)。物种丰富度(species richness， S)是指群落所包含的物种数目，表明群落或生境中物种数目的多寡。本实验中丰富度以泳道中所有条带数目表示。Shannon 指数的算法采用如下公式：H' =-∑piln(pi)， (pi=ni/ N)，其中ni 为单个条带的光密度，N 为所有条带的光密度[6]。

(1)组间条带数目(S)存在显著差异(P=0.000)，两两比较发现：

组HN+CP 与组HN 相比减少具有统计学意义P=0.000；

组HN+CP 与组N 相比减少具有统计学意义P=0.007；

组CP 与组HN 相比减少具有统计学意义P=0.001。

图1 PCR-DGGE 图谱

表1 4 组样本多样性(±s)

表1 4 组样本多样性(±s)

HN+CP CP HN N S 12.6±2.1 15.6±1.5 22.6±3.2 18.5±4.0 H' 0.896±0.091 0.978±0.104 1.119±0.090 1.06±0.094

(2) 组间Shannon 指数(H’)存在显著差异(P=0.012)，两两比较发现：

组HN+CP 与组HN 相比减少具有统计学意义P=0.002；

组HN+CP 与组N 相比减少具有统计学意义P=0.021；

组CP 与组HN 相比减少具有统计学意义P=0.034。

2.3 条带类型分析 共发现36 种不同类型的条带(图2，Band type 1-36)。6 个条带(Band type 3、13、22、28、29、31)在约80%以上的样本中均有出现，其中Band type 29 的检出率为100%，提示上述微生物不随全身和牙周状况的变化而改变。5 个条带(Band type 2、14、15、35、36)在约半数的非牙周炎组(组HN 和组N)中检出，在牙周炎组(组HN+CP 和组CP)未检出，其中Band type 14在75%的健康对照组(组N)中检出，其他组鲜见；Band type 1 在单纯高血压组(组HN)的检出率为80%，其他组鲜见；Band type 26 在高血压组(组HN+CP 和组HN)的检出率(70%)高于非高血压组(组CP 和组N)(22%)；提示在不同血压和牙周状况下，唾液群落构成发生改变。

图2 条带类型分析(绿色(+)代表存在，红色(-)代表不存在)

2.4 测序及比对结果 选择具有代表性的条带Band type1、3、14、29(对应图1 中A、B、C、D)，切胶回收后送交北京六合华大基因科技股份有限公司测序，测得结果使用NCBI GenBank 在线BLAST 同源性搜索程序进行比对，以同源性最高的序列来确定同源性信息(表2)。

表2 测序比对结果

3. 讨论

高血压和慢性牙周炎在老年人中发病率高，均是复杂的多因素疾病。近年来的研究通过口腔微生物将二者联系起来，有学者将牙周炎称为是一种系统的慢性低度感染条件[7]，而高血压是一种促炎状态。Moise 等[8]应用DNA-DNA 棋盘杂交技术对11 种龈下细菌的检测发现，龈下牙周致病菌水平与SBP/ DBP 的升高及高血压患病率直接相关。本实验4 个差异条带中A 为未获培养细菌；B 简明弯曲菌(Campylobacter concisus)在约80%以上样本中均有出现，可分离自牙龈炎和牙周炎患者的龈沟，但其在口腔的定植及致病性尚不清楚[9]；C 韦荣菌属(Veillonella sp.)在大部分健康对照组中检出，与Paster 等[10]的观点相一致；牙周炎相关的D变黑普氏菌(Prevotella nigrescens)在所有样本中均有检出，说明该菌是口腔正常菌群的一部分，当菌群失调、口腔生态平衡被打破时即成为条件致病菌。

研究发现，大量与慢性牙周炎相关的致病菌均能在唾液中检出[11]；慢性牙周炎患者唾液中某些主要致病菌如齿垢密螺旋体的检出较健康人高[12]；牙龈卟啉单胞菌和齿垢密螺旋体在唾液和龈下菌斑中的检出率无显著差异，而变黑普雷沃菌在唾液中的检出率高于龈下菌斑[13]。唾液作为口腔微生态系统的一个重要组成部分，与口腔各个位点相沟通，是细菌的天然运载介质，并提供牙菌斑生物膜形成的环境，其组成和波动可以直接或间接地反映口腔微生物群落结构的动态变化，与口腔感染性疾病如龋病和牙周病关系密切。同时，唾液取样简单，无痛，具有无创性，操作者无需特殊训练，唾液检测有望成为一项新而简便的口腔健康状况监测和治疗效果评估手段[14]。

本实验采用PCR-DGGE 技术对老年高血压患者的唾液微生物群落进行总体初步分析，提示高血压患者在保证口腔健康的前提下，其唾液微生物种类多样性可不发生明显改变，口腔唾液菌群可保持其生态平衡状态；而高血压是一种促炎状态，当高血压患者的牙周组织同时存在炎症时，高血压可导致炎症加重，进而造成口腔整体生态平衡被打破，某些具有致病潜力的细菌繁殖占优势，从而抑制、替代了其他细菌的生长，造成其多样性降低。

必须指出的是：多数高血压患者需终身服药，且存在联合用药，抗高血压药物对唾液微生物群落的影响尚需进一步研究以明确其机制；老年人的义齿佩戴情况，BMI 指数，血胆固醇含量，牙周炎的严重程度等因素也应考虑在内，有待进一步研究。同时，本实验样本量偏少，因扩大样本量后会导致不同带型的DGGE 图谱，且多张图谱比较会增加误差且出现条带共聚现象[15]，本实验仅为初步探讨。DGGE 技术在鉴定菌种方面较传统培养方式具有明显的优势，能够全面地反映微生物整体群落信息，从而对群落组成整体结构进行研究。但是该技术难以精确分析细菌代谢活性、数量和基因表达水平方面的信息[16]，再结合其他方法， 可使其对微生物的研究更加深入。

[1] Haraszthy VI，Zambon JJ，Trevisan M，et al. Identification of periodontal pathogens in atheroma plaques[J].J Periodontol，2000，71(10): 1554-1560

[2] Aas JA，Paster BJ，Stokes LN，et al. Defining the normal bacterial flora of the oral cavity [J]. J Clin Microbiol，2005，43(11): 5721-5732

[3] Li Y，Saxena D，Barnes VM，et al. Polymerase chain reaction-based denaturing gradient gel electrophoresis in the evaluation of oral microbiota [J]. Oral Microbiol Immunol，2006，21(5): 333-339

[4] Ramseier CA，Kinney JS，Herr AE，et al. Identification of pathogen and host-response markers correlated with periodontal disease[J]. J Periodontol，2009，80(3):436-446

[5] 中国高血压防治指南修订委员会.中国高血压防治指南2010[J].中华心血管病杂志，2011，19(8):705-706

[6] Gafan GP，Lucas VS，Roberts GJ，et al. Statistical analyses of complex denaturing gradient gel electrophoresis profiles[J].J Clin Microbiol，2005，43(8): 3971-3978

[7] D’Aiuto F，Readv D，Touetti MS，et al. Periodontal disease&C-reactive protein-associated cardiovascular risk[J].Jounal of PeriodontalResearch，2004，39(4):236-241

[8] Desvarieux Moise，Demmer Ryan T ，Jacobs David R，et al. Periodontal bacteria and hypertension: the oral infections and vascular disease epidemiology study (INVEST)[J]. Journal of Hypertension，2010，28(7):1413-1421

[9] 周学东，肖晓蓉. 口腔微生物学[M]. 成都: 四川大学出版社，2002:149-150

[10] Bruce J Paster，Ingar Olsen，Jørn A Aas，et al.The breadth of bacterial diversity in the human periodontal pocket and other oral sites[J]. Periodontology 2000，2006，42:80-87

[11] Paju S，Pussinen P J，Suominen-Taipale L，et al. Detection of multiple pathogenic species in saliva isassociated with periodontal infection in adults[J]. J Clin Microbiol，2009，47(1):235-238

[12] Martnez-Pab nM C，Restrepo-Ospina D P，Isaza-Guzmn D M，et al. Detection of Treponema denticola in saliva obtained from patients with various periodontal conditions[J]. Clin Oral Investig，2008，12(1): 73-81

[13] Umeda M，Contreras A，Chen C，et al. The utility of whole saliva to detect the oral presence of periodontopathic bacteria[J]. J Periodontol，1998，69: 828-833

[14] Ollila P S，M A Larmas. Long-term predictive value of salivary microbial diagnostic tests in children[J]. Eur Arch Paediatr Dent，2008，9(1): 25-30

[15] Machado JC，Tulio GV. On the use of denaturing gradient gel electrophoresis approach for bacterial identification in endodontic infections [J]. Clin Oral Invest， 2007， 11 (2):127-132

[16] Muyzer G，Waal EC，Uitterlinden AG.Profiling of complex microbial populations by denaturing gradient gel electrophoresis analysis of polymerase chain reaction amplified genes encoding for 16SrRNA[J]. App l Environ Microbiol，1993，59(3): 695-700