10个半滑舌鳎家系MHC IIB基因多态性初步研究

牛宝珍,杜 民,陈松林

(1.红河学院 云南省高校农作物优质高效栽培与安全控制重点实验室,云南 蒙自 661199;2.中国水产科学研究院黄海水产研究所 农业部海洋渔业可持续发展重点开放实验室,山东 青岛 266071)

主要组织相容性复合体(major histocompatibility complex,MHC)是目前已经研究的脊椎动物基因组最具多态性区域,它的编码产物在获得性免疫中起着很大的作用[1-2],这些编码产物结合抗原肽以及与T细胞受体(TCR)相互作用从而激发一个特定的免疫反应[3-4]。已经报道了鱼类中 MHCⅠ类和Ⅱ类分子,它们结合不同的T细胞而分为两类MHC基因编码蛋白[5]。鱼类上 MHC基因的研究开始于 Hashimoto等[6]1990年对鲤鱼(Cyprinus carpio)的研究。目前,许多鱼类MHC基因已经被分离出来,包括鲨鱼(Carcharodon carcharias)[7-8]、丽鱼(Alticorpus macrocleithrum)[9]、大菱鲆(Scophthalmus maximus)[10]、大黄鱼(Pseudosciaena crocea)[11]、鲤鱼[12]等。

半滑舌鳎(Cynoglossus semilaevis)属鲽形目(Pleuronectiformes)、舌鳎科(Cynoglossidae)、舌鳎属(Cynoglossus),俗称牛舌、鳎目、鳎米等,分布于中国黄渤海,在东海、南海、也有分布[13]。在鳎类中半滑舌鳎为个体偏大种类,因其味道优美,营养丰富受消费者喜爱,已经成为中国新开发的养殖品种[14];半滑舌鳎的MHCⅠ类基因[15]、β2m基因[16]、Ⅱ类A和Ⅱ类 B[17]已经被确定出来。每个 MHCⅡ类 B基因编码区多态性最高片段是其第二外显子编码的β1结构域[18];β1结构域和MHCⅡ类A基因编码的α1结构域一起组成了MHCⅡ类分子的多肽结合槽,从而能够锚定外源多肽[19]。MHC基因的高度变异使得在一个群体中产生了大量等位基因,每个等位基因或多或少的具有结合和呈递不同类型多肽的能力[5]。因此,一个有机体对特定抗原的反应可能受到 MHC基因单倍型的影响。鱼类中,大西洋鲑(Salmo salar)MHCⅡ类基因多态性已经被研究[20-21],Du等[22]对牙鲆(Paralichthys olivaceus)7个家系中的 MHCⅡ类基因多态性进行研究并且对大菱鲆的MHC的抗迟钝爱德华氏菌(Edwardsiella tarda)与MHCⅡ类基因的特定基因型的关联性进行了相关研 究[23]。

本实验室于2008年采用雄性野生群体与雌性养殖群体生产出18个半滑舌鳎家系[24]。本研究目的是检测10个半滑舌鳎家系MHCⅡB(Cyse-DAB)基因的多态性水平、MHCⅡ类B位点数目以及平衡选择的作用,为半滑舌鳎的分子标记辅助育种提供基础性资料。

1 材料和方法

1.1 实验鱼

2008年 9月,在山东省莱州明波水产养殖公司建立半滑舌鳎全同胞家系和半同胞家系,亲本来源、家系建立饲养情况参照陈松林等[24]的报道。

1.2 取样及DNA提取

从10个普通半滑舌鳎家系中各随机选取5尾鱼,每尾体质量7～8 g,利用MS222(1g/kg)麻醉后剪取尾鳍保存在无水乙醇中。利用酚-氯仿方法[25],从尾鳍中提取半滑舌鳎总的 DNA。用 1%的琼脂糖凝胶进行电泳,在凝胶成像仪上进行 DNA浓度检测,并将其浓度均调至为100 ng/µL,–20℃保存。

1.3 引物设计和多聚酶链式反应(PCR)

根据 Xu等[15]报道的 cDNA序列设计的特定引物: hMPN12 (5′-CTCTCTTCTCTTCCTCCTCAC-3′)和 hMPC-12 (5′-ACACTCACCTGATTTAGCCA-3′),扩增半滑舌鳎 MHCⅡB第二外显子序列,上游引物和下游引物分别位于第一外显子和第二外显子的末端。

25 μL的PCR反应混合物包含1 μL的半滑舌鳎基因组DNA模板、2.5 μL的10×TaqDNA多聚酶缓冲液(TransGen Biotech)、1.5 mmol/L MgCl2、0.2 mmol/L dNTPs、0.2 μmol/L的特定引物(正向引物和反向引物)、1 UTaq多聚酶。PCR反应程序为94℃预变性5 min、然后30个循环(94℃变性40 s、53℃退火40 s、72℃延伸50 s),最后72℃延伸10 min。PCR反应在Peltier 热循环仪(PTC-200)上完成。利用凝胶成像系统(Molecular Imager Gel Doc XR Biorad美国)检测确认扩增片段。

1.4 克隆和DNA序列测定

切割预期大小PCR产物的胶并且利用QIAEXII凝胶回收试剂盒(QIAGEN)进行回收纯化。根据操作说明书将纯化产物连接到 PBS-T载体后,转化到TOP10大肠杆菌感受态细胞。利用M13的正向和反向引物进行 PCR筛选阳性克隆;每个体的扩增产物选5个克隆在ABI3730自动测序仪上用M13+/–引物测序。

1.5 基因型、序列分析和统计检验分析

利用 DNAMAN软件对所有的序列数据进行比对分析。同义替换(dS)与非同义替换(dN)的比率用MEGA4.0软件[26]中修正 Nei和 Gojobori的成对-距离方法[27]进行估算。用 DAMBE软件和 DnaSP5.0软件用来分析序列核苷酸值[28]。用SPSS13.0软件来进行统计分析。根据Davies等[29]报道的规则命名新发现的等位基因[30-31]。

2 结果与分析

2.1 10个半滑舌鳎家系中MHC II第二外显子序列的多态性

本研究中从10个家系共选取50个体,每个体选取5个克隆进行克隆及测序,得到250个序列。根据已发表的半滑舌鳎MHCⅡB cDNA序列[17]和内含子-外显子的GT-AG剪接规则,共得到397 bp片段,包含35 bp的第一外显子、整个第一内含子(84 bp,包含一个12bp的CA重复序列)以及完整的第二外显子序列(270 bp)。第二外显子编码MHCⅡB基因的β1结构域。有些序列仅发现一次,推测可能是由于 PCR错误所致,如错配、Taq DNA 聚合酶错误等。另外大肠杆菌异源双链修复错误也是可能原因[32-33]。删除这些序列后得到60个不同的序列,有32个序列与本实验室已获得序列相同[34],本研究中新发现28个,代表 28个不同的等位基因,并递交到 GeneBank上(表 1)。

10个家系中每个体选取 5个克隆进行测序,只发现1个等位基因的有2个个体,发现2个等位基因的有6个体,发现3个等位基因的有21个体,发现4个等位基因的有15个体,发现5个等位基因的有6个体。表 2 显示每个体等位基因数目及对应个体的数目,在10个半滑舌鳎家系中MHCⅡB基因上,只有 4% 的检测个体是纯合体(所有的家系都是杂合的),亦即在4#和19#家系中各出现一个纯合体(所测的序列完全相同)。各个家系等位基因的频率在每个家系中的分布不具有显著性。1#、3#、4#、6#、16#、19#、24#、28#、33#、34#家系中出现的序列和全部序列相似性分别为 89.89%、94.26%、88.24%、92.35%、94.67%、93.7%、90.37%、90.16%、93.22%、88.84%和89.36%。

在得到的 60个 MHCⅡB基因第二外显子序列中没有发现插入、缺失和终止密码子,表明这些序列来自于半滑舌鳎基因组的功能位点。在60个序列中,每个位点核苷酸多态性值Pi (p)和Theta-W值分别是0.14008和0.08975;270个核苷酸位点中有113个变异位点: 其中91个是简约信息位点。单倍型多样性值(H)和核苷酸差异平均数目(k)分别为1和37.823。

表1 等位基因和Genbank登录号Tab.1 Alleles and their GenBank accession number

表2 10个半滑舌鳎家系中每尾鱼的Scma-DAB等位基因数目和5种等位基因情况下的个体数目Tab.2 The allele number per individual in 10 half-smooth tongue sole families and the individual number in five different allele models

2.2 半滑舌鳎MHCⅡB 基因选择作用

在半滑舌鳎MHCⅡB基因第二外显子多肽结合区(PBR),23个氨基酸位点中有20(86.96%)个是变异位点,并且在69个核苷酸中有40(57.97%)个是变异位点。在60个序列的多肽结合区中,非同义替换(dN)和同义替换(dS)的值分别是0.285和0.127,非同义替换(dN)与同义替换(dS)的比值为 2.2441;而在非多肽结合区中,非同义替换(dN)和同义替换(dS)的值分别为 0.095和 0.130,表明在多肽结合区经历着正向的达尔文选择(表3)。表3列出了每个家系代表序列在多肽结合区的非同义替换和同义替换的比值,只有28#家系个体中的多肽结合区的非同义替换与同义替换的比率不具有显著性外,另外的 9个家系中的多肽结合区的非同义替换显著高于同义替换,表明在这些家系中个体MHCⅡB基因多肽结合区的碱基经历达尔文选择。半滑舌鳎多肽结合区推断和鉴定是根据Brown等[19]对人类HLA-DRB 基因相应区域的限定。

3 讨论

MHCⅡB 基因最多态性的区域是由β链第二外显子非同义替换造成的。在本研究中,作者利用PCR和直接测序方法揭示了 10个半滑舌鳎家系中 MHC classⅡB 基因第二外显子基因多态性和选择作用;也有其他鱼类的相关报道: Xu 等[35]在 12个牙鲆家系60个体中发现76个等位基因;Rakus等[36]在9个鲤鱼品系中发现 7个不同的 MHC classⅡB 基因单倍型并且这些单倍型的频率也不相同;Stet等[37]在84个大西洋鲑个体上发现 7个 Sasa-DAA和 7个Sasa-DAB等位基因;Langefors等[38]通过直接测序在25个波罗的海大西洋鲑的22个限制性片段长度多态单倍型中确认17个MHC classⅡB基因第二外显子等位基因。作者对50个半滑舌鳎家系个体中发现60个MHCⅡB等位基因表明半滑舌鳎遗传多样性较高。

表3 10个半滑舌鳎家系中MHCⅡB 基因第二外显子中多肽结合区(PBR)、非多肽结合区(non-PBR)的同义替代率(dS)和非同义替代率的比值及显著性分析Tab.3 Synonymous(dS)and non-synonymous(dN)substitution rates and significant levels in the putative peptides binding region(PBR)and non-peptides binding region(non-PBR)among half-smooth tongue sole alleles

本研究半滑舌鳎个体中,有6个个体出现5个不同等位基因,从而推测半滑舌鳎的 MHCⅡB基因至少存在3个位点或者拷贝,这与Xu等[17]的研究结果相一致。相似的报道也在其他鱼类中发现: 李华等[39]利用PCR-SSCP和直接测序的方法对猪SLA-DQB基因第二外显子进行分析后发现有的个体中存在 5个不同等位基因现象,从而推断在有些品种猪中具有3个DQA基因拷贝或位点;张玉喜等[40]通过直接测序发现84个牙鲆个体中有59个体表现2种或2种以上不同序列,并且其中有一个个体中发现有 5种不同的序列,推测这些个体具有较高的杂合度或者至少存在3个不同的基因位点。本文每个体仅测了5个克隆,是否增加克隆数就可以有发现更多的等位基因呢？这在以后的类似的工作中要作进一步验证。

关于MHCⅡB基因第二外显子多态性的假说有:杂种优势、超显性选择、频率依赖的选择或平衡选择[41]。目前许多相关研究支持平衡选择假说[42-43],平衡选择经常通过在多肽结合区的非同义替换率(dN)与同义替换(dS)的比率来进行推断。如果dN/dS的比率显著高于1,则表明正向选择在起作用。在本研究的10个半滑舌鳎家系MHCⅡB序列中,除28#家系中的 MHCⅡB基因序列多肽结合区(PBR)的非同义替换比率与同义替换比率不具有显著性外(Z检验的P=0.054＞0.05),另外9个家系中MHCⅡB基因序列在多肽结合区(PBR)的非同义替换要显著高于同义替换(表3)。据此认为在半滑舌鳎MHCⅡB基因进化过程中受到正向选择的影响,从而产生如此多的等位基因。作者发现在半滑舌鳎MHCⅡB基因的多肽结合区上非同义替换高于同义替换,推测半滑舌鳎MHCⅡB基因可能与人类 HLA-DRB基因具有相似的功能[19]。各等位基因在个体及家系中出现的频率也不同,可能是由于个体对环境的选择压力不同而造成的[43]。本研究发现的 60个等位基因中,有 32个等位基因所在实验室已有报道[34],另外28个等位基因为新发现,表明等位基因也具有个体或者群体差异。

总之,在10个家系50个体中发现了60个序列,表明在半滑舌鳎的MHCⅡB基因第二外显子具有高度多态性,为下一步在半滑舌鳎家系间 MHCⅡB等位基因与抗/易感特定病原间的相关性研究提供基础资料。

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