益肾通络方中二苯乙烯苷的含量测定

凌 晓，谷 捷，金 一，邓 虹，金 红

（1. 湖南师范大学医学院，长沙 410006；2. 湖南中医药大学中医学院，长沙 410007）

益肾通络方是临床上治疗肾病综合征的有效方剂，由黄芪、制何首乌、丹参、山茱萸等中药组成，具有补肾化瘀的功效。临床及实验研究表明，该复方对肾病综合征之肾虚夹瘀证有较好的治疗作用［1，2］。我们的前期研究发现，建立的HPLC-ELSD法可简便、高效地对方中君药黄芪的有效活性成分黄芪甲苷含量进行检测［3］。为进一步了解该方的作用机制、明确其物质基础并为质量控制提供参考，我们选用了方中的另一味君药制首乌进行研究。首乌有补肝肾、益精血的功效［4，5，6］；现代医学研究发现，作为何首乌的主要有效成分之一的二苯乙烯苷类化合物有降低血脂、降低胆固醇、调节机体免疫功能等作用［7，8］。中国药典将二苯乙烯苷作为检测何首乌的定量指标［9］，但对于制首乌中二苯乙烯苷的含量没有限定。因此我们采用高效液相色谱法对方中的二苯乙烯苷进行了定量研究。

1 资料与方法

LC-2010A HT高效液相色谱仪（日本岛津）；Milli-Q超纯水净化仪；0.45μm 微孔滤膜（天津奥德赛恩斯仪器有限公司）；超声波清洗机（型号AS3120A，天津奥德赛恩斯仪器有限公司）；乙腈（色谱纯）；重蒸水自制；其余试剂均为分析纯。二苯乙烯苷对照品（中国食品药品检定研究院，批号：110844-201109）。实验所用药材均购自湖南省中医药研究所和老百姓大药房。

2 结果

2.1 供试液的制备 按处方量称取制首乌（复方按比例称定），研碎，煎煮一小时、过滤，收集滤液；将残渣再煎煮半小时、过滤并收集滤液。合并两次收集的滤液并浓缩成含生药1.5g/mL的流浸膏备用。

取10m L流浸膏，加入80%甲醇水溶液150m L水浴回流1h，提取液水浴挥干，然后用无水甲醇溶解，定容于25.00mL容量瓶中，超声15min，让二苯乙烯苷充分分散于溶剂中，静置，取上清液过0.45μm微孔滤膜，获得复方和制首乌单品的供试液［10］。另按处方比例称取缺制首乌的阴性样品，研碎，同上述步骤制备阴性样品供试液。

另精密称取二苯乙烯苷对照品13.8mg，用甲醇溶解，定容于25.00mL容量瓶中，摇匀，即得对照品溶液。

2.2 二苯乙烯苷的含量测定

2.2.1 色谱条件 色谱柱为BP-C18柱（5μm，4.6×250mm），流动相为乙腈-水（25︰75），流速为1.0mL/min，柱温30℃，检测波长320nm，进样量10μL。理论塔板数按2，3，5，4’-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷峰计算不应低于2000。

2.2.2 专属性考察 分别精密吸取对照品溶液、供试品溶液、复方及阴性样品溶液各10μL，进样，记录色谱图（见图1）。结果表明：黄芪甲苷与供试品溶液中其他组分分离良好，其他药材成分对黄芪甲苷的测定无干扰，方法的专属性良好。

图1 对照品（A）、制首乌单品（B）、益肾通络方（C）和阴性样品（D）溶液的高效液相色谱图

2.2.3 线性关系考察 分别精密吸取上述对照品溶液1.0、5.0、10.0、15.0、20.0μL按上述色谱条件进行分析，测定峰面积，以对照品含量（μg）为纵坐标（Y），对照品峰面积（A）为横坐标（X），绘制标准曲线，得回归方程Y=0.5571×10-6X-2.4247，r=0.9996。结果表明，二苯乙烯苷在0.76~15.15μg范围内线性关系良好。

2.2.4 精密度 以浓度为0.5227mg/mL的二苯乙烯苷对照品溶液连续5 次进样10μL，测定二苯乙烯苷峰面积值，RSD=0.8%（n=5）。说明方法的精密度良好，溶液在测定过程中稳定。

2.2.5 重复性 精密称取制首乌药材中粉适量5份，按供试品溶液制备项下方法处理，按上述色谱条件分析测定，二苯乙烯苷平均含量为0.92%，RSD为1.8%（n=5），说明方法重复性较好。

2.2.6 稳定性 精密吸取取同一批供试品溶液，分别于配制后0，2，6，8，12h测定，二苯乙烯苷峰面积的RSD为1.2%，表明该供试品溶液在12h内基本稳定。

2.2.7 加样回收率 精密称取同批益肾通络方样品5份各14.1g，研碎，按2.1项下“供试液的制备”方法处理，置于锥形瓶中。分别精密加入定量二苯乙烯苷标准品，进样，按上述色谱条件测定，得平均回收率99.1%，RSD为1.87%。结果见表1。

表1 加样回收试验结果

2.2.8 益肾通络方中二苯乙烯苷的含量测定 经测定，益肾通络方中二苯乙烯苷的平均含量为9.257 mg/g，结果见表2。

表2 益肾通络方中二苯乙烯苷的含量：

2.3 配伍对二苯乙烯苷含量的影响 分别称取制首乌单品与益肾通络方各五份（所含制首乌均为1.5g），按2.1项下“供试液的制备”方法处理，按2.2.1色谱条件测定，得到二苯乙烯苷的峰面积数据见表3。经两总体方差齐同的成组t检验分析，得= 629644.6，t=3.72，查表得P<0.05，可认为两组数据总体均数有统计学差异。

表3 配伍前后二苯乙烯苷的含量（峰面积）变化

3 讨论

益肾通络方作为临床上治疗肾病综合征的验方［11］，对肾虚夹瘀证有较好的治疗作用，制首乌为方中君药。以往的研究发现，二苯乙烯苷作为何首乌的主要有效成分之一，有降血脂、降胆固醇及调节机体免疫功能的作用，但对于肾脏的作用机制报道少见。本研究对制首乌中二苯乙烯苷进行提取，开始选用乙醇作为溶剂，结果发现杂质较多，影响色谱分析。后改用甲醇情况有所改善。经反复试验，最终确定选用80%甲醇水浴回流1h提取含量较高。根据实验数据可知，二苯乙烯苷在方中含量为0.926%，可作为益肾通络方的一项重要质量控制指标。通过对首乌单品和复方中的二苯乙烯苷进行的含量比较发现，二苯乙烯苷经复方配伍后含量减少。经统计学分析，含量变化存在显著性差异（P<0.05）。

中药多以复方入药，其功能是以单味药的功效为基础，但不是简单单味药功效的总和，而是由其药效组分所决定，制首乌经配伍后，其中的二苯乙烯苷的含量已经显著减少。由此更能说明中药复方制剂的质量标准制定必然是要往建立多药味、多组分的含量测定这条路上走。其配伍前后的含量差异亦可为临床药理研究提供参考和方向。

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［2］金红, 杨智, 刘慧萍, 等. 益肾通络方对C-BSA肾病综合征大鼠模型的整体治疗作用［J］. 辽宁中医杂志, 2008, 35(10): 1597-1600.

［3］凌晓, 金红, 杨智, 等. 益肾通络方中黄芪甲苷的含量测定［J］. 湖南中医杂志, 2013, 29(2): 119-121.

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［5］李燕, 王慧娟, 林冰, 等. 贵州何首乌HPLC指纹图谱研究［J］. 中药材, 2012, 35(12): 1928-1932.

［6］张进, 黄进, 徐志伟. 何首乌含药血清促进MSCs增殖的效应及机理研究［J］. 中药新药与临床药理, 2011, 22(1): 12-15.

［7］谢岚. 何首乌及二苯乙烯苷的研究进展［J］. 天津药学, 2010, 22(3):70-73.

［8］粟力杰. HPLC法测定何首乌中二苯乙烯苷的含量［J］. 中国当代医药, 2010, 17(18): 41-42.

［9］国家药典委员会. 中国药典2010版(第一部). 北京: 中国医药科技出版社, 2010. 1.

［10］徐向红, 平欲晖, 谢一辉. 制何首乌四个有效成分含量的高效液相色谱法测定［J］. 时珍国医国药, 2011, 22(1): 58-59.

［11］金红, 凌晓, 李雅, 等. 健康大鼠服用益肾通络方后血清中阿魏酸的RP-HPLC测定［J］. 湖南师范大学学报(医学版), 2007, 4(4):9-10, 13.