小檗碱对大鼠肝硬化肝组织IFN-γ表达与端粒酶活性的影响

骆中华，吕飞

(华中科技大学同济医学院附属普爱医院消化科，武汉 430035)

小檗碱对大鼠肝硬化肝组织IFN-γ表达与端粒酶活性的影响

骆中华，吕飞

(华中科技大学同济医学院附属普爱医院消化科，武汉 430035)

目的 探讨小檗碱抑制血吸虫肝硬化组织恶性变潜能的作用及其机制。方法 将80只大鼠感染日本血吸虫尾蚴，随机分为A、B、C、D组，每组20只。模型对照组(A组)不作任何治疗；吡喹酮组(B组)感染尾蚴6周后给予吡喹酮500 mg·kg-1·d-1灌胃2 d；小檗碱组(C组)感染尾蚴6周后给予小檗碱150 mg·kg-1·d-1灌胃6周；小檗碱+吡喹酮组(D组)在感染尾蚴6周后给予吡喹酮500 mg·kg-1·d-1灌胃2 d，再以小檗碱150 mg·kg-1·d-1灌胃6周。另取10只大鼠作为正常对照组(E组)。第12周末分别留取各组大鼠肝组织，检测肝脏Ⅰ、Ⅲ型胶原及干扰素-γ(IFN-γ)含量、端粒酶活性与端粒酶反转录酶(TERT)表达情况。结果 与A组比较，B组和C组肝纤维化程度均减轻，肝组织IFN-γ含量显著升高，端粒酶活性与TERT表达水平降低(P<0.05)。与B组比较，C组大鼠肝纤维化程度、IFN-γ含量及端粒酶活性、TERT表达水平无明显差异(P>0.05)。与B组、C组比较，D组大鼠肝纤维化程度进一步减轻，肝组织IFN-γ含量显著升高(P<0.05)，端粒酶活性及TERT表达水平显著降低(P<0.05)。结论 小檗碱可通过调节大鼠肝组织内免疫应答，促进IFN-γ表达，抑制肝组织TERT表达及端粒酶活性，可配合吡喹酮对大鼠晚期血吸虫肝硬化起协同、增效作用。

小檗碱；吡喹酮；干扰素-γ；肝硬化；血吸虫；端粒酶反转录酶；端粒酶

日本血吸虫肝病与肝癌的关系日益受到关注。流行病学和动物实验资料均表明，血吸虫感染在肝组织恶变中起到了某种直接或间接作用，抑制血吸虫肝纤维化组织恶性变潜能成为防治血吸虫病不可忽视的重要内容之一[1]。小檗碱是黄连的提取物，目前研究发现，小檗碱中具有抗肝纤维化、抑制肝癌细胞增殖的作用[2-3]，但未见其作用于血吸虫肝病的研究报道。笔者在本实验中以日本血吸虫尾蚴感染大鼠建立血吸虫肝纤维化模型，并给予小檗碱治疗，观察治疗前后大鼠肝组织Ⅰ、Ⅲ型胶原和干扰素-γ(interferon-γ，IFN-γ)含量、端粒酶(telomerase)活性以及端粒酶反转录酶(telomerase reverse transcriptase，TERT)表达变化，探讨小檗碱抑制血吸虫肝纤维化的作用及其机制。

1 材料与方法

1.1 动物 清洁级雄性Wistar大鼠，体质量220～250 g，购自华中科技大学同济医学院动物实验中心。实验动物生产许可证号：SCXK(鄂)2010-0009，动物许可证号：HBDW NO：2008-1015。

1.2 药物与试剂 盐酸小檗碱片(东北制药总厂生产，批号：130136，规格：每片0.1 g)，吡喹酮片(武汉康隆世纪医药制造有限公司产品，批号：CP2010，含量：99.8%，规格：每片0.5 g)。上述药物使用时以0.9%氯化钠溶液配成悬浊液。抗大鼠TERT抗体购自美国Santa Cruz公司(批号：SC-68270)。端粒酶重复序列扩增及酶联免疫吸附技术(polymerase chain reaction-Telomeric repeat amplification-Enzymek-linked immunosorbent assay,PCR-TRAP-ELISA)试剂盒购自福州迈新生物技术开发有限公司(批号：11854666910)。抗大鼠Ⅰ型胶原抗体(批号：BA0325)、抗大鼠Ⅲ型胶原抗体(批号：BA0326 )及链霉亲和素-生物素复合物(strept avidin-biotin complex,SABC)试剂盒(批号：SA1052)均购自武汉博士德生物工程有限公司。 IFN-γ ELISA 试剂盒购于美国PERPTOTECH 公司(批号：400-20)。

1.3 大鼠血吸虫病肝纤维化模型的建立及分组 将每只大鼠经腹部皮肤人工感染血吸虫尾蚴25条，将感染后的大鼠80只随机分为A、B、C、D组，每组20只。模型对照组(A组)感染尾蚴后不作任何治疗；吡喹酮组(B组)感染尾蚴6周后予吡喹酮500 mg·kg-1·d-1灌胃2 d，qd；小檗碱组(C组)感染尾蚴6周后给予小檗碱150 mg·kg-1·d-1灌胃6周[4]，qd。小檗碱+吡喹酮组(D组)感染尾蚴6周后给予吡喹酮500 mg·kg-1·d-1灌胃2 d，再给予小檗碱150 mg·kg-1·d-1灌胃6周，qd。另取10只大鼠作为正常组(E组)。E组大鼠同时灌胃等体积0.9%氯化钠溶液。感染血吸虫尾蚴后第12周末，A、B、C、D、E组分别存活10，12，13，15，10只，将各组大鼠处死后取相同部位肝组织保存备用。

1.4 免疫组化检测Ⅰ、Ⅲ型胶原 采用SABC法，肝组织标本染色后采用MPZAS-500多媒体彩色病理图文分析系统，计算平均积分吸光度值(A值)。

1.5 ELISA法检测肝组织IFN-γ含量 取大鼠肝组织样本(每份100 mg)，加入0.9%氯化钠溶液在冰水中匀浆。以3 000×g离心5 min，取上清液，按照IFN-γ试剂盒说明测定IFN-γ含量。

1.6 Western blot 检测各组肝组织TERT 取大鼠肝组织样本(每份100 mg)，匀浆、离心后吸取上清液，按照BCA 蛋白含量测定试剂盒说明进行蛋白定量测定。等量蛋白质样品经分离后转移于硝酸纤维素膜(polyviny lidene fluoride,PVDF) 膜，以1：1 500兔抗大鼠TERT单克隆一抗4 ℃静置孵育过夜，再以1：15 000过氧化物酶标记的山羊抗兔IgG二抗室温孵育2 h，暗室用增强化学发光(enhanced chemilumine scence,ECL)试剂盒发光显影，同时检测β-actin的表达作为内参对照。图片经吸光度图像扫描仪(HP) 扫描，以Quantity One 软件对结果进行分析，检测各组大鼠肝组织TERT与β-actin表达灰度的比值。

1.7 PCR-TRAP-ELISA法检测端粒酶活性 取大鼠肝组织(每份150 mg)，研碎，离心，取上清液进行聚合酶链反应，按照试剂盒说明书进行操作。分别测定样品与阳性对照在波长450及630 nm处A值。端粒酶相对活性=(样本A450-A630/阳性对照A450-A630)×150。

2 结果

2.1 肝组织Ⅰ、Ⅲ型胶原含量 E组大鼠肝组织无明显胶原着色。A组、B组及C组肝内Ⅰ、Ⅲ型胶原呈棕黄色，密集片状，主要分布在虫卵肉芽肿内及汇管区。与A组比较，B组、C组大鼠肝组织Ⅰ、Ⅲ型胶原含量显著下降(P<0.05)。D组肝组织Ⅰ、Ⅲ型胶原含量亦显著下降(P<0.01)。与B组比较，C组大鼠肝组织Ⅰ、Ⅲ型胶原含量无明显差异(P>0.05)，D组Ⅰ、Ⅲ型胶原含量较B组、C组显著下降(P<0.05)，见图1，2及表1。

2.2 肝组织IFN-γ含量 与A组比较，B组、C组大鼠肝组织IFN-γ含量均明显升高(P<0.05)。D组肝组织IFN-γ含量亦明显升高(P<0.01)。与B组比较，C组大鼠肝组织IFN-γ含量无明显变化(P>0.05)。与B组、C组比较，D组大鼠肝组织 IFN-γ含量显著升高(P<0.05)(表2)。

2.3 肝组织TERT表达 与A组比较，B组、C组肝组织TERT含量均显著下降(P<0.05)；与B组比较，C组肝组织TERT含量无明显下降(P>0.05)，而D组肝组织TERT含量较B组、C组均显著下降(P<0.05)(图3，表2)。

2.4 肝组织端粒酶活性 与A组比较，B组、C组肝组织端粒酶活性均显著下降(P<0.05)；与B组比较，C组肝组织端粒酶活性无明显下降(P>0.05)，而D组肝组织端粒酶活性较B组、C组均显著下降(P<0.05)(表2)。

3 讨论

大量流行病学调查发现，并发感染日本血吸虫病的慢性病毒性肝炎患者，肝癌发病率明显增高，表明日本血吸虫感染可促进肝癌发生[5]。目前研究表明，血吸虫及其形成的肝脏肉芽肿性炎症、纤维化是肝癌发生的高危因素之一。虫卵肉芽肿导致的炎症反应可降低细胞免疫功能，促使正常肝细胞中原癌基因p53等变异而成为癌基因和(或)致抑癌基因失活[6]，易导致细胞恶变。

图1 5组大鼠肝组织Ⅰ型胶原表达情况(×200)

图2 5组大鼠肝组织Ⅲ型胶原表达情况(×200)

与A比较，*1P<0.05，*2P<0.01；与B组比较，*3P<0.05；与C组比较，*4P<0.05

Compared with group A，*1P<0.05，*2P<0.01; compared with group B，*3P<0.05；compared with group C，*4P<0.05

端粒酶异常活化是癌细胞无限增殖的关键，90%以上肿瘤细胞中端粒酶活性显著增加，而正常细胞或组织中几乎没有检测到端粒酶活性。因此端粒酶活性增高是区别正常细胞和肿瘤细胞的显著特征，端粒酶活性可用作肿瘤诊断、治疗及判断预后的指标之一[7]。TERT是端粒酶活性的主要催化亚单位，为端粒酶的必需和限速组成成分，仅存于端粒酶阳性表达的细胞中。

图3 5组大鼠肝组织TERT表达(Western blot )

与A组比较，*1P<0.05，*2P<0.01；与B组比较，*3P<0.05；与C组比较，*4P<0.05

Compared with group A，*1P<0.05，*2P<0.01; compared with group B，*3P<0.05; compared with group C，*4P<0.05

研究发现，原发性肝癌组织中TERT表达较癌旁组织明显升高，而肝炎组织、肝硬化组织未见明显TERT表达[8]。

IFN-γ作为Th1细胞的特征性细胞因子，发挥调节细胞免疫应答功能的重要作用[9]。IFN-γ能激活巨噬细胞、NK细胞等直接杀伤癌细胞。IFN-γ可通过抑制癌基因的表达来阻止或减慢肿瘤细胞的转化过程，从而直接抑制肿瘤细胞生成与生长。研究发现，可通过促进肝细胞凋亡和细胞周期阻滞抑制肝癌细胞生长[10]。

A组大鼠肝纤维化组织端粒酶活性和TERT 表达明显增强，提示血吸虫肝纤维化组织具有产生恶性变的潜能。A组肝组织IFN-γ水平升高考虑可能为血吸虫成虫和虫卵肉芽肿产生的毒性代谢产物诱导免疫应答反应而呈现的反应性增高。吡喹酮治疗后血吸虫肝纤维化组织端粒酶活性和TERT 表达明显下降，表明吡喹酮可在一定程度上抑制血吸虫肝纤维化恶性变潜能发展，其机制可能为吡喹酮通过杀死血吸虫成虫、减少毒性代谢产物产生而减轻炎症反应，促进IFN-γ表达而抑制血吸虫肝纤维化恶性变潜能进一步发展。吡喹酮治疗后血吸虫肝纤维化组织端粒酶活性和TERT表达仍明显高于E组，提示杀虫治疗后有必要尽早加用适宜药物，以防血吸虫肝纤维化组织恶性变潜能进一步发展。

应用小檗碱治疗时肝组织IFN-γ表达明显增高，而TERT表达、端粒酶活性明显下降，表明小檗碱可通过促进IFN-γ表达降低端粒酶活而发挥抑制血吸虫肝纤维化恶性变潜能发展的作用。较之应用吡喹酮，小檗碱治疗端粒酶活性和TERT表达并无明显下降。由此推测杀虫治疗能减少血吸虫虫卵及虫卵肉芽肿的来源,在抑制血吸虫纤维化组织恶性变潜能发展的治疗中可能仍发挥重要作用。值得注意的是，吡喹酮继之以小檗碱治疗可使血吸虫肝硬化组织中TERT表达和端粒酶活性较之吡喹酮或小檗碱治疗明显下降，推测两者配合应用在抑制血吸虫肝硬化恶性变潜能发展方面可起到协同、增效作用。

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DOI 10.3870/yydb.2015.03.006

Effects of Berberine on the Expression of IFN-γ and Activity of Telomerase in Rat Liver Cirrhosis Tissue

LUO Zhonghua,LY Fei

(DepartmentofGastroenterology,PuaiHospital,TongjiMedicalCollege，HuazhongUniversityofScienceandTechnology，Wuhan430035，China)

Objective To study the inhibitory effect and mechanism of berberine on the malignant potential of liver cirrhosis tissue due to schistosoma. Methods Eighty rats infected withschistosomajaponicumwere equally divided into A， B， C and D groups, twenty rats in each.Group A was taken as model control without any treatment.Group B was treated with praziquantel at 500 mg·kg-1·d-1for 2 days.Group C was treated with berberine at 150 mg·kg-1·d-1for 6 weeks.Group D was treated with berberine at 150 mg·kg-1·d-1for 6 weeks followed by praziquantel treatment at 500 mg·kg-1·d-1for 2 days.Ten rats were taken as normal control group (group E).At 12th week， all rats were sacrificed and parts of liver tissues were preserved.The contents of IFN-γ，typeⅠ collagen， type Ⅲ collagen， telomerase reverse transcriptase (TERT )and the activity of telomerase in liver tissue before and after treatments were detected. Results Compared to the group A， the therapy of praziquantel or berberine singly reduced the contents of typeⅠand type Ⅲ collagens，TERT and the activity of telomerase and greatly raised the content of IFN-γ(P<0.05 ).Compared to the group B， there was no difference on the contents of IFN-γ，typeⅠ collagen，type Ⅲ collagen，TERT and the activity of telomerase in liver tissue between two groups(P>0.05).Compared to the group C or group B， the contents of typeⅠ collagen，type Ⅲ collagen，TERT and the activity of telomerase in liver tissue were obviously reduced and the content of IFN-γ was conspicuously elevated (P<0.05 ) in the group D. Conclusion Berberine can inhibit the malignancy by inhibiting the expression of TERT and the activity of telomerase via regulating immune response and promoting the expression of IFN- γ in liver tissue.Berberine may be used in symergism with the insecticidal treatment for advanced schistosomal hepatic cirrhosis.

Berberine；Praziquantel; Interferon-γ；Liver cirrhosis；Schistosomahepaticcirrhosis； Telomerase reverse transcriptase；Telomerase

2014-02-06

2014-03-10

骆中华(1969-)，男，湖北武汉人，副主任医师，学士，研究方向：肝脏疾病防治。E-mail：tomz120@163.com。

R282.7；R965

A

1004-0781(2015)03-0306-04