蝽类昆虫干制标本基因组提取及相关基因扩增

赵清，张佳庆，张虎芳

（1.山西农业大学 农学院，山西 太谷 030801;2.南开大学 生命科学学院，天津， 300071)

蝽类昆虫干制标本基因组提取及相关基因扩增

赵清1，张佳庆2，张虎芳1

（1.山西农业大学 农学院，山西 太谷 030801;2.南开大学 生命科学学院，天津， 300071)

本文以辉蝽（Carbulahumerigera)（半翅目：蝽科)为实验材料，研究蝽科昆虫干制标本基因组的提取并扩增相关基因。通过CTAB法、SA裂解法及吸附柱法，对50头辉蝽干制标本进行了基因组提取试验，并针对mtDNA的COI基因部分片段和nrDNA的ITS2基因部分片段进行PCR扩增，共获得COI序列6条，ITS2序列33条。结果表明，核基因中的ITS2基因扩增效果相对较好，而线粒体中的COI基因扩增效果并不理想。通过对PCR产物电泳，结果显示，1994－2008年的干制标本，3种基因组提取方法均可行，且已获得基因序列无明显差别;1974－1989年的干制标本，SA裂解法所造成的核酸损失大，提取效果不理想，而CTAB法、吸附柱法效果明显。由于CTAB法耗时较长、对实验材料需求量大、破坏较强且涉及如β－巯基乙醇等有毒试剂，SA法对基因组损失太大且杂质保留较多，所以提取蝽科干制标本及扩增相关基因的最优方法为二氧化硅膜吸附柱法。

干制标本;基因提取;基因扩增

半翅目蝽类昆虫是昆虫纲中一个较大的类群，全世界已知38 000余种［1］，其中包括很多有益类群和很多有害类群。近些年，随着分子生物技术的发展，人们对昆虫的研究开始深入到了分子水平，尤其是在系统分类、分子系统发育和进化等方面［2，3］。在研究过程中一些稀有类群很难获得新鲜材料，因此往往需要用博物馆或标本馆的干制标本提取基因组DNA，但干标本保存时间越长基因组DNA的降解也越严重，提取效果就越不理想［4］。因此，从干标本中有效的提取基因组DNA对昆虫分子生物学研究至关重要。

1 材料与方法

1.1 试验材料

本实验所采用的标本为均为南开大学昆虫研究所分子系统学实验室多年来积累的辉蝽干制标本，分别采于2008（5头)、2006（6头)、2003（6头)、2002（5头)、2001（4 头)、2000（6 头)、1999（6 头)、1994（3头)、1989（3头)、1986（3头)、1974（3头)（表1)。

PCR扩增采用如下引物：

1.2 试验方法

将干制标本取一侧足，将其浸泡于盛有TE的1.5mL离心管中，为防止标本污染，在DNA扩增前将其做一些预处理。本研究采用3种方法（1)CTAB法［5］、（2)二氧化硅膜吸附柱法（康为世纪CW0546)、（3)Chelex 100裂解液法（康为世纪CW0556)对同一年干制标本mtDNA的COI基因片段及nrDNA的ITS2基因片段进行扩增。证据标本编号后，存放于南开大学昆虫学标本馆。

PCR反应采用50μL体系（表2)，反应参数设置参照赵婉清等［6］文献。经 PCR 扩增后，用1.0%的琼脂糖凝胶电泳检测，将有条带的PCR产物送至金维智测序公司测序。获得数据后，对序列进行整理，所用方法参照赵清［7］文献。

表1 实验所用标本详细信息Table 1 Details of specimens investigated in the study

续表1

表2 使用Taqase酶的反应体系（50μL)Table 2 The reaction composition using Takara Polymerase

2 结果与分析

本实验以辉蝽（C.humerigera)干制标本为实验材料，通过CTAB法、SA法和吸附柱法进行基因组提取，针对mtDNA的COI基因和nrDNA的ITS2基因进行PCR扩增。结果表明COI基因扩增不稳定，50头标本仅扩增出6条序列，序列长度为700bp，其中CTAB法有2008年和2003年扩增成功，SA法有2008、2006、2003年扩增成功，而二氧化硅膜吸附柱法仅有1994年扩增成功。ITS2片段则稳定许多，50头标本扩增出33条序列，序列长度为833bp，从2008－1974年的实验标本均可以顺利提取并扩增出相应片段，条带明亮且重复性好，PCR产物测序结果峰图较好，没有出现乱峰套峰的现象（图2)。

由于材料有限，对干制标本基因组提取目前只研究至1974年（40年前)。在提取2008－1994年的蝽类干制标本时，在取材量相近的情况下，3种方法提取出的基因以模板量2μL扩增的ITS2片段经电泳后，紫外灯下观察，其亮度并无明显差别;对于1989、1986、1974年的标本，取材均为两条足，基因扩增时模板量分为2μL、4μL、6μL，经PCR扩增、电泳检测后发现，CTAB法与吸附柱法所提基因量相近，SA法所提基因量比前2种方法要少些，PCR原液条带明显比其他2种方法暗（图1)。

图1 ITS2基因的PCR电泳图Fig.1 Electrophoretogram of the ITS2gene

图2 不同年份标本的ITS2部分碱基序列峰图（540～620bp)Fig.2 Trace files（electropherograms)showing the same fragment（between 540bp and 620bp)of the subunit ITS2in different years

3 结论与讨论

近些年，对干制标本基因组提取方法的研究越来越多［8～11］，但是针对半翅目蝽类昆虫干制标本基因提取及扩增的研究较少，大多数是为了满足实验需要使用的零星干制标本。如李红梅等基于18SrDNA序列的蝽次目（半翅目：异翅亚目)系统发育关系的研究中只是用了几头干制标本，且没有提及蝽科标本的名称及采集时间［12，13］;Damgaard＆Zettel关于水黾（异翅亚目：黾蝽科)遗传多样性等方面的研究中采用的少量标本为干制标本，其中最久远的实验材料为10年前的标本［14］;Hebsgaard等基于线粒体DNA 16SrRNA和核糖体28SrDNA序列及形态学的水生蝽类昆虫（半翅目－异翅亚目：蝎蝽次目)的研究中，年代最久远的干制标本采于1995年。

Lis等对干制标本中线粒体基因组的提取做了较全面系统的研究，从5科48头干制标本中扩增出线粒体DNA 16SrRNA和12SrRNA，并成功提取出了1894年的蝽类干制标本基因［3］。但此研究中所扩增序列长度仅为460bp，实验步骤较繁琐且对实验材料需求量较大，常需要选取一个完整的蝽类标本进行浸泡处理，除去其前胸背板或头部来挑取足量的胸部肌肉进行实验，所以会对标本造成极大破坏，影响形态学研究。

提取基因组最传统的方法为CTAB法，对提取干制标本基因的效果较明显，即便是近40年的标本也可以很好地将线粒体DNA提取出来，但此过程涉及的有机试剂具有一定的毒性，如β－巯基乙醇，且裂解之后的操作步骤较为繁琐，耗时较长，全过程需要一天的时间。另外，在抽提过程中容易造成较大程度的核酸损失，在洗涤沉淀时也存在一定的概率会将沉淀冲走，导致提取失败。由于CTAB法对实验材料需求量较大，取材时一般是将整头辉蝽标本进行浸泡，并需通过除去辉蝽的前胸背板或头部而取出其胸部肌肉进行实验，对标本破坏较大，所以综合来看，CTAB法并不是一个足够安全且高效稳定的提取干制标本基因的方法，但其优点是成本低。

本研究所采用的SA法在提取干制标本基因组时方便快捷，且耗时短，只需5h即可完成，但其裂解组织的过程中对基因损耗较大，所以裂解时间不宜过长，以2.5h为宜。SA法对提取近20年的干制标本基因效果很好，若年代再久远一些，则效果不明显。另外，提取过程中对杂质的保留较多，有时会影响后续PCR反应，所以也不是最优的提取方法。

二氧化硅膜吸附柱法实验时间较CTAB法短很多，5h即可完成全部提取实验，且所用的试剂对身体无毒害;同时其提取效果比较稳定，对于40年前的干制标本，要比SA裂解法提取效果好很多，且在抽提洗脱过程中要经过多次过滤，能有效的除掉许多杂质。综合考虑，二氧化硅膜吸附柱法既兼具了SA裂解法和CTAB法的优点，又有效的规避了他们在实验过程中的明显缺陷，是一个最优的提取蝽类干制标本基因的方法。

本研究中所扩增的COI基因片段约700bp，且仅扩增5条，分析其原因，可能为实验所用的干制标本，虽然保存在理想的环境中，但是由于年代久远，线粒体DNA已经断裂成小片段，所以本实验所选用的引物未能扩增出，亦或是实验所用干制标本已经不含可以扩增的内源性线粒体DNA。当扩增ITS2基因时，无论是CTAB法、SA法还是吸附柱法结果均显示能成功提取并扩增，除了1989年、1986年和1974年略暗外，并无明显差异。

综上，可以得出：（1)吸附柱法综合了CTAB法和SA法两者的优点，时间短，5h就可以完成提取基因组过程，所用试剂对身体无毒害，综合考虑是最优的提取基因组的方法。（2)当干制标本不能满足实验需求时，可以考虑干制标本，无论是线粒体DNA还是核DNA都可以提取基因组的。但是当干制标本的线粒体DNA降解严重时，长片段很难扩增，此时可以考虑扩增一些短的片段（如100～200bp)，之后将短片段拼接成长片段。

本研究表明，蝽类干制标本适合种群遗传学研究，在很多情况下，取昆虫一条足就可以提取核基因ITS2，同时我们可以改进其他的试验方法以获取长片段的线粒体COI基因。本研究工作对蝽类昆虫其他科或属的分子系统学及进化研究具有重要意义，对于一些稀缺物种能够充分利用标本室积累的干制标本，缩短研究时间，节省人力和物力。

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Extract DNA from Dry Specimens of Pentatomidae and Amplify the Related Genes

Zhao Qing1，Zhang Jiaqing2，Zhang Hufang1
（1.CollegeofAgriculture，ShanxiAgriculturalUniversity，TaiguShanxi030801，China;2.CollegeofLifeSciences，NankaiUniversity，Tianjin300071，China)

This paper tookCarbulahumerigera（Hemiptera：Pentatomidae)as main material to study DNA extraction from dried specimens and amplify the related genes.Fifty dried specimens collected from 1974to 2008were analyzed.CTAB，SA lysis and Silical coating column methods were all used to extract genes from one side legs of each specimen.The mitochondrial DNA （COIgene fragment)and the nuclear rDNA （ITS2gene fragment)were successfully amplified from six specimens and thirty-three specimens，respectively.The comparison of results demonstrates that all the three methods are feasible for the specimens from 1994to 2008and no obvious difference was found among the sequences from different methods.However，for the specimens as far back as 1974to 1989，the SA lysis method lost DNA a lot，while the other methods not.Since the CTAB method costs much time，destroys specimens a lot by peeling chest muscle and uses toxic organic solvents such as 2-mercaptoethanol，in SA method，the genome lost too much and the impurity contained a lot，so the Silical coating column method is turned out to be the best method of extracting DNA from dried specimens and amplifying the related genes.

Dried specimen;DNA extraction;Gene amplification

S433.3

A

1671-8151（2015)03-0478-05

10.13842/j.cnki.issn1671-8151.2015.05.006

2015-06-01

2015-06-25

赵清（1985-)，女（汉)，山东临沂人，讲师，博士，研究方向：DNA分类学。

张虎芳，教授，硕士生导师。Tel：0354- 6288225;E-mail：zh＿hufang＠sohu.com

国家自然基金（31440078)，山西省教育厅高等学校科技创新基金（2014131)，山西农业大学科技创新基金（2014017)

（编辑：马荣博)