杨树EBP1基因的克隆与表达载体构建

李慧+李爱+彭立新+阎国荣

摘要：器官大小是植物形态的重要表现特征之一，也是决定一些作物或经济植物产量和品质的重要因素。研究证实，草本植物如拟南芥中EBP1类转录因子可从细胞数量和体积2个方面同时调控植物器官大小，但该基因在木本植物杨树中的结构及功能仍未知。本研究依托杨树全基因组及EST数据信息，采用生物信息学方法结合基因同源序列克隆，首次对杨树中的EBP1全长cDNA进行克隆及序列分析，同时成功构建了用于遗传转化的过表达载体。

关键词：杨树;EBP1基因;克隆;表达载体;构建;基因序列分析;蛋白同源性比对

中图分类号： Q943.2 文献标志码： A

文章编号：1002-1302（2015）04-0014-03

收稿日期：2014-05-25

基金项目：天津市高等学校科技发展基金（编号：20120619）;天津市应用基础与前沿技术研究计划（编号：14JCQNJC15000）。

作者简介：李 慧（1981—），女，河北廊坊人，硕士，讲师，主要从事植物分子生物学研究。E-mail：lihui@tjau.edu.cn。

通信作者：阎国荣，博士，教授，主要从事植物资源学研究。E-mail：yanguorong@eyou.com。

自然界中植物种类繁多、形态各异，其中器官大小是造成植物形态多样性的主要因素之一。不同植物间器官大小可能存在显著差异，但就同一物种内相同基因型的不同植物个体而言，在相同的生长环境下它们的器官大小基本一致，表明植物各器官最终大小的形成受到严格的遗传调控[1]。因此，近年来从不同植物中挖掘参与器官大小发育调控的基因或转录因子并揭示其调控机制的研究备受关注，并已在拟南芥和一些农作物如水稻、玉米、油菜、番茄、马铃薯等中取得了长足的研究进展[1-2]。有研究发现，在外界生长条件一致的情况下，植物各器官的最终大小在细胞水平上受细胞数量和大小的协同控制[3]。因此，分离、克隆参与调控植物细胞数量和大小的基因并阐释其功能是揭示植物器官大小发育控制机制的关键。目前，在拟南芥等草本植物中已有多个相关基因和转录调控因子被成功分离和克隆。有研究表明，AINTEGUMENTA（ANT）[4]、ANGUSTIFOLIA3（AN3）[5]、GROWTH-REGULATING FACTOR5（AtGRF5）[5]、GRF-INTERACTING FACTOR（GIF）[6-7]、JAGGED（JAG）[8]、STRUWWELPETER（SWP）[9]、SWELLMAP1（SMP1）[10]、KLUH（KLU）[11]、EBP1[12]及Auxin-Regulated Gene involved in Organ Size（ARGOS）[13-14]等主要通过正向调控细胞增殖能力控制器官内细胞数量，进而影响器官大小。这些基因的异位过表达可通过延长细胞增殖时间导致植物器官变大，而突变则会导致植株器官整体变小。另外，还有一些基因通过调控细胞大小来影响器官的大小，如ARGOS-LIKE（ARL）[15]、ROTUNDIFOLIA3（ROT3）[16]、AtGRF1/2[17]、BIGPETAL[18]、AtTOR[19]、ORGAN SIZE RELATED1（OSR1）[20]等，其中拟南芥中EBP1被证实对植物细胞数量和大小均能发挥正向调控作用[12]。拟南芥EBP1是和人类的ErbB-3表皮生长因子受体结合蛋白同源的一个基因，与核糖体的生物合成相关，该基因在进化上具有较高的保守性。目前除在拟南芥外，在沙冬青和马铃薯中也有该基因序列的相关报道，但该基因在其他植物中的功能仍未知，特别是在木本植物中，尚未有该基因的相关报道。因此，本研究对杨树中EBP1基因进行克隆，并对其表达载体进行构建。相关研究对进一步揭示杨树EBP1的功能具有重要意义，同时对采用基因工程等手段提高林木产量和品质具有潜在的应用价值。

1 材料与方法

1.1 试验材料

黑杨（Populus nigra），种植于南开大学校园内;pEASY-T1载体，购于北京全式金生物技术有限公司;植物表达载体pBI121、农杆菌LBA4404，均由笔者所在实验室保存。

1.2 方法

1.2.1 黑杨总RNA提取及反转录 采用改良的CTAB法提取黑杨叶片总RNA，以Oligo dT（18）为逆转录引物，在 M-MLV 作用下逆转录成cDNA。

1.2.2 引物设计及同源克隆 以拟南芥及其他草本植物中已经报道的EBP1基因DNA及cDNA序列为种子序列，利用Blast序列比对软件搜索杨树基因组及EST数据库，获得杨树中候选EBP1基因序列。随后根据筛选、获得的杨树中EBP1候选序列设计引物，进行扩增，并对扩增结果进行测序验证。进一步对NCBI数据库中收集的杨树EBP1相关EST序列进行分析，结合测序结果，对杨树中EBP1基因全长cDNA序列进行克隆及序列分析。

1.2.3 杨树EBP1表达载体构建及分子鉴定 根据已获得的杨树EBP1候选基因全长cDNA序列，设计带有酶切位点的全长cDNA扩增引物，对EBP1全长cDNA进行扩增及 T-A 克隆。挑取含有杨树EBP1全长cDNA的阳性克隆，放大培养并提取质粒，通过双酶切获得带有黏性末端的EBP1全长cDNA序列。进而与经过相同双酶切的植物表达载体pBI121采用T4连接酶进行连接，最终获得EBP1重组表达载体。将重组载体转入大肠杆菌感受态细胞，在LB+卡那霉素（Kan）板上筛选阳性克隆进行菌液PCR和酶切验证，进而获得插入方向和序列完全正确的阳性克隆。随后将该阳性克隆放大培养，采用质粒提取试剂提取重组质粒，并采用冻融法将该重组质粒导入农杆菌LBA4404感受态细胞，在YEB+链霉素（str）+利福平（Rif）板上筛选阳性克隆进行菌液PCR验证。

2 结果与分析

2.1 杨树EBP1基因的克隆

根据序列同源性分析结果，设计引物对EBP1-1F：5′-ATGTCGTCAGACGACGAGA-3′和 EBP1-1R：5′-TTCCTAGACGGCGGTGG-3′，以黑杨cDNA为模板对杨树中EBP1候选基因进行克隆。扩增结果显示，黑杨中EBP1候选基因全长cDNA约为1.2 kb（图1）。将获得的cDNA通过T-A克隆方法，连入pEASY-T载体，挑取阳性克隆进行测序。测序结果显示，杨树中EBP1基因全长cDNA序列长度为1 215 bp，将其命名为PtEBP1。

2.2 杨树PtEBP1的生物信息学分析

根据测序结果，对获得的PtEBP1进行进一步的序列分析。同源性比对结果显示，PtEBP1与已报道的沙冬青和马铃薯EBP1基因具有较高的同源性，其中与沙冬青EBP1蛋白序列的同源性为89%，与马铃薯EBP1蛋白同源性为87%（图2）。保守结构域分析结果显示PtEBP1含有1个PA2G4-like-domain，这个结构域属于APP_MetAP超家族（图3）。由此推测杨树PtEBP1基因应属于转录因子APP_MetAP超家族的一个成员。

2.3 PtEBP1表达载体的构建

为对PtEBP1的功能及作用机制进行探究，本试验进一步对PtEBP1植物表达载体进行构建。首先通过对PtEBP1的序列分析，结合pBI121载体酶切位点信息，确定选用XbaⅠ和SacⅠ对pBI121载体进行切割;随后设计带有XbaΙ和SacⅠ切割序列的引物PtEBP1-F：5′-TCTAGAATGTCGTCAGACGACGAGA-3′和PtEBP1-R：5′-GAGCTCCTAGACGGCGGTGG-3′用于扩增PtEBP1，将扩增序列通过T-A克隆方法导入pEASY-T1质粒，挑取阳性克隆并提取质粒，对质粒进行XbaⅠ和SacⅠ双酶切消化处理后，获得带有双酶切位点的目的片段，与经过同样双酶切的pBI121的载体进行连接（图4）。

上述连接产物转化大肠杆菌感受态细胞，在含有卡那霉素抗性的LB平板上筛选阳性克隆，PCR检测显示阳性重组克隆中含有1.2 kb的目的片段;阳性重组克隆进一步经过XbaⅠ和SacⅠ双酶切后也能产生1.2 kb的目的片段（图5）。这表明杨树EBP1基因已成功构建入植物转基因表达载体pBI121中。

2.4 农杆菌LBA4404中表达载体的菌液PCR鉴定

采用冻融法将已构建好的表达载体pBI121-PtEBP1转化农杆菌（LBA4404）感受态细胞，在含有链霉素和利福平的YEB固体培养基上进行筛选。随机挑取4个阳性克隆进行菌液PCR，PCR扩增产物均为1.2 kb（图6），证明表达载体已成功转入农杆菌中。

3 结论与讨论

EBP1是拟南芥中和人类ErbB-3表皮生长因子受体结合蛋白同源的一个基因，与核糖体的生物合成有关，可以同时控制细胞的分裂和延伸，从细胞数量和体积2个方面同时调控植物器官大小。EBP1基因以剂量依赖型方式调节植物器官大小，同时也以生长素依赖形式对细胞周期调节因子进行调控[12]，该基因与蛋白合成密切相关，并参加调控细胞周期，在调节植物器官大小方面具有重要意义。

杨树是重要的用材和绿化树种，具有经济和生态双重价值。但和其他绝大多数木本植物一样，杨树生长周期也较长，遗传背景复杂，很难在短时间内创造出大量突变体。因此，长期以来对杨树等木本植物器官形态建成及生长发育调控机制等基本问题的研究远远落后于拟南芥等草本植物。而2006年杨树全基因组测序的完成[21]及随后不断丰富完善的杨树及其近源种的EST数据信息，为采用生物信息学手段结合反向遗传学策略探究杨树生长发育机制等基本问题提供了一条有效途径。

本研究通过克隆获得的杨树PtEBP1基因应属于转录因子APP_MetAP超家族的一个成员。通过蛋白同源性比对发现，杨树PtEBP1与已报道的与沙冬青、马铃薯的EBP1蛋白同源性高达89%、87%。同时，本研究已将杨树PtEBP1基因构建入植物转基因表达载体pBI121中，并成功转入农杆菌LBA4404中，为进一步开展杨树中EBP1类转录因子的功能研究、深度解析杨树生长发育优势形成的分子基础奠定了重要的基础。

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