藜麦总黄酮的超声波法提取及抗氧化活性

董晶+张焱+曹赵茹+李志英

摘要：用超声法探讨提取藜麦黄酮的最佳工艺，并测定其自由基的清除能力及对淀粉酶的降解作用。结果表明，最佳提取条件为：料液比为1 g ∶ 50 mL，乙醇浓度80%，提取温度50 ℃，提取时间30 min，超声功率为240 W。藜麦黄酮提取液对DPPH·、·OH的清除能力分别为89.3%、86.6%，对淀粉酶的抑制率为41.38%。

关键词：藜麦;黄酮;抗氧化性

中图分类号： R284.2 文献标志码： A

文章编号：1002-1302（2015）04-0267-03

收稿日期：2014-05-20

基金项目：忻州师范学院应用化学创新实践基地（编号：院政字201331）;忻州师范学院大学生科技创新项目（编号：2012.1022）。

作者简介：董 晶（1992—），从事分析化学研究。

通信作者：李志英，教授，从事分析化学教学与科研工作。E-mail：lizhiying8001@163.com。

藜麦（Chenopodium quinoa Willd.）原产于南美洲安第斯山区，是印加土著居民的传统食物，有7 000多年的种植历史。联合国粮农组织认为，藜麦是唯一的单体植物即可满足人体基本营养需求的食物[1]。藜麦含有丰富的类黄酮物质，有助于血液循环、软化血管，可明显促进糖脂代谢、胰岛素分泌，对糖尿病有很好的疗效。藜麦黄酮具有抗氧化[2]、抗癌及防癌[3]、降压及降血脂、改善微循环、抑菌、消炎等功效，是极具开发前景的天然有机抗氧化剂。本研究对藜麦黄酮的最佳提取条件进行了探究，并研究了其体外清除DPPH·、·OH自由基的能力，旨在为开发利用藜麦资源提供依据。

1 材料与方法

1.1 主要试剂

藜麦（山西稼祺农业科技有限公司）。准确称取 0.020 2 g 芸香苷标准样品（北京化学试剂公司），用少量无水乙醇溶解后用80%无水乙醇定容至100 mL容量瓶中，得0.202 mg/mL芸香苷溶液。准确称取5 g硝酸铝（天津市风船化学试剂科技有限公司），用蒸馏水定容于100 mL容量瓶中，即得5%硝酸铝溶液。准确称取0.166 8 g硫酸亚铁（天津市风船化学试剂科技有限公司），用少量蒸馏水溶解，定容于100 mL容量瓶中，得6 mmol/L硫酸亚铁溶液。准确移取0.6 mL 30%过氧化氢（天津市风船化学试剂科技有限公司），定容于1 L容量瓶中，得6 mmol/L H2O2溶液。准确称量0082 9 g 水杨酸（天津市申泰化学试剂公司），用少量无水乙醇溶解，定容于100 mL容量瓶中，得6 mmol/L水杨酸溶液。准确称取 19716 mg DPPH·，用无水乙醇溶解定容至250 mL 容量瓶中，得 2×10-7 mol/L DPPH·溶液。其他试剂均为分析纯，试验用水为二次蒸馏水。

1.2 主要仪器

UV-2550型紫外-可见分光光度计[日本岛津公司（苏州）]，FA22048电子天平（上海精密科学仪器有限公司），KQ-400KDE型台式高功率数控超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司），723型分光光度计（上海光谱仪器有限公司）。

1.3 方法

1.3.1 藜麦黄酮的提取方法 将新鲜的藜麦置于65 ℃烘箱内烘干至恒质量，粉碎后过60目筛，备用。称取藜麦粉末2 g置于100 mL锥形瓶中，加入80 mL 80%乙醇溶液，240 W 50 ℃下超声提取30 min，用80%乙醇溶液定容至100 mL容量瓶中，抽滤，作为待测液[3]。

1.3.2 藜麦黄酮的测定方法 精密称取干燥至恒质量的芸香苷标准品0.020 2 g置于烧杯中，用少量的无水乙醇溶解，并用80%乙醇溶液定容于100 mL容量瓶中，摇匀。准确吸取标准样品0、0.2、0.4、0.6、0.8、1 mL，分别置于10 mL比色管中，加入5%Al（NO3）31 mL，用80%乙醇溶液定容，摇匀，静置5 min。在405 nm处测定吸光度。当芸香苷浓度范围为4.04～20.2 μg/mL时，与吸光度有良好的线性关系[4]，得回归方程：D=0.034 3C+0.010 2，r2=0.999。准确量取稀释后的提取液0.5 mL，按标准曲线的方法测定其吸光度。黄酮得率（W）计算公式如下：

W=V/（f×m×1 000）×100%。

（1）

式中：V为提取液总体积，f为稀释倍数，m为藜麦总质量。

1.3.3 藜麦黄酮抗氧化性研究

1.3.3.1 对DPPH·清除率的测定 以最优条件提取藜麦黄酮，稀释、定容，得0.202 mg/mL藜麦黄酮提取液。用无水乙醇分别配制不同浓度藜麦黄酮溶液。在 10 mL 比色管中分别加入待测溶液1 mL与DPPH·溶液 2 mL，混匀，避光静置 30 min，在 517 nm 处测定吸光度D。每一吸光度平行测定3次，取平均值。清除率计算公式如下：

DPPH·清除率=（D空白-D样品+D对照）/D空白×100%。

（2）

式中：D空白表示 2 mL 无水乙醇代替待测液得到的吸光度;D对照表示 2 mL 无水乙醇代替待测液得到的吸光度。

1.3.3.2 对羟自由基（·OH）清除率的测定 利用 H2O2对 Fe2+混合产生·OH，在体系内加入水杨酸捕捉·OH 并产生有色物质，该物质在 510 nm 下有最大吸光度。准确吸取1 mL不同质量浓度的藜麦黄酮提取液置于10 mL比色管中，依次加入2 mL 6 mmol/L FeSO4 、2 mL 6 mmol/L水杨酸-乙醇、2 mL 6 mmol/L H2O2，37 ℃反应30 min，以蒸馏水为参比，在510 nm 下测量各浓度的吸光度[5]。不同浓度藜麦黄酮溶液 1 mL 为黄酮的本底吸收。清除率计算公式如下：endprint

·OH清除率=D0-（Di-Dj）D0×100%。

（3）

式中：D0表示不加提取液时空白溶液的吸光度;Di表示加入提取液时溶液的吸光度;Dj表示不加H2O2提取液本底的吸光度。

1.3.4 降糖作用的测定 α-淀粉酶水解淀粉为还原糖，3，5-二硝基水杨酸DNS与还原糖反应显示红棕色，540 nm处比色，定量测定α-淀粉酶的活性。取0.3 mL α-淀粉酶 37 ℃ 预热5 min，加入0.4 mL 1%淀粉溶液在37 ℃下反应 5 min，加入0.2 mL DNS，沸水浴5 min后，取出冷却，定容至25 mL，540 nm下测定吸光度[5]。在反应体系中加入不同浓度提取液1 mL，空白对照为不加提取液（以蒸馏水补足）。背景对照为对应浓度的提取液，反应终止后用蒸馏水稀释定容至25 mL，于540 nm处测其吸光度。抑制剂对α-淀粉酶的抑制率计算公式如下：

抑制率=（1-D3-D4D1-D2）×100% 。

（4）

式中：D1、D2、D3、D4分别为540 nm处空白、空白对照、提取液、背景对照的吸光度。

2 结果与分析

2.1 乙醇浓度的影响

称取2 g样品，分别加入50%、60%、70%、80%、90%乙醇溶液80 mL，超声功率240 W 30 ℃超声辅助提取30 min，定容至100 mL容量瓶中，抽滤。准确吸取2 mL提取液，测其吸光度，得黄酮得率与乙醇浓度的关系。由表1可知，黄酮得率随乙醇浓度的增加而增加，当乙醇浓度达80%时，黄酮得率最大，当乙醇浓度再增大时，黄酮得率开始下降，因此乙醇最佳浓度为80%。

表1 乙醇浓度的选择

乙醇浓度（%） 黄酮得率（%）

50 0.20

60 0.23

70 0.24

80 0.34

90 0.26

2.2 料液比的影响

称取2 g样品，分别加入20、30、40、50、60 mL 80%乙醇，240 W 30 ℃超声辅助提取30 min，定容至100 mL容量瓶中，抽滤。准确吸取2 mL提取液，测其吸光度，得黄酮得率与料液比的关系。由表2可知，黄酮得率随着料液比的增大而增加，当料液比为1 g ∶ 50 mL时黄酮得率最大，当料液比再增大时，黄酮得率开始下降，因此最佳料液比为1 g ∶ 50 mL。

2.3 提取时间的影响

称取2 g样品，加入80 mL 80%乙醇溶液，240 W 30 ℃超声辅助提取10、20、30、40、50 min，定容至 100 mL 容量瓶中，抽滤。准确吸取2 mL提取液，测其吸光度，得到黄酮得率与

表2 料液比的选择

料液比（g ∶ mL） 黄酮得率（%）

1 ∶ 20 0.21

1 ∶ 30 0.29

1 ∶ 40 0.33

1 ∶ 50 0.42

1 ∶ 60 0.30

提取时间的关系。由表3可知，黄酮提取率随提取时间的增大而增加，当提取时间为30 min时，黄酮提取率最高，继续延长提取时间，黄酮提取率下降，因此最佳提取时间为30 min。

表3 提取时间的选择

提取时间（min） 黄酮得率（%）

10 0.25

20 0.31

30 0.33

40 0.31

50 0.28

2.4 提取温度的影响

称取2 g样品，分别加入80 mL 80%乙醇溶液，分别在30、40、50、60、70 ℃超声辅助提取30 min，超声功率240 W，定容至100 mL容量瓶中，抽滤。准确吸取2 mL提取液，测其吸光度，得黄酮得率与提取温度的关系。由表4可知，黄酮得率随提取温度的增大而增加，当提取温度为50 ℃时黄酮得率最大，再增加提取温度，黄酮得率开始下降，因此最佳提取温度为50 ℃。

表4 提取温度的选择

提取温度（℃） 黄酮得率（%）

30 0.21

40 0.27

50 0.32

60 0.29

70 0.28

2.5 超声功率的影响

称取2 g样品，分别加入80 mL 80%乙醇溶液，30 ℃分别在160、200、240、280、320 W功率下超声辅助提取30 min，定容至100 mL容量瓶中，抽滤。准确吸取2 mL提取液，测其吸光度，得黄酮得率与超声功率的关系。由表5可知，黄酮得率开始随超声功率的增大而增加，当功率为240 W时黄酮得率最大，再增大超声功率，黄酮得率下降，因此最佳超声功率为240 W。

表5 超声功率的选择

超声功率（W） 黄酮得率（%）

160 0.26

200 0.28

240 0.34

280 0.31

320 0.29

2.6 机理探讨

准确吸取芸香苷标准品溶液、藜麦黄酮提取液各2 mL，分别置于10 mL比色管中，各加入1 mL Al（NO3）3溶液，振荡，用80%乙醇溶液定容，摇匀，静置5 min。用紫外可见分光光度计确定最大吸收波长。在300～600 nm波长范围内扫描，得标准品、提取液的吸收光谱。由图1可知，标准品配合物、提取液配合物的最大吸收波长均为405 nm，故本试验用该波长作为测定波长。

2.7 藜麦黄酮抗氧化性endprint

2.7.1 藜麦黄酮对DPPH·的清除作用 DPPH自由基有单电子，在517 nm处有一强吸收，其醇溶液呈紫色。当藜麦黄酮存在时，由于与其单电子配对而使其吸收逐渐消失，其褪色程度与其接受电子数量成定量关系。由表6可知，藜麦黄酮对DPPH·清除效果明显，在5～25 μg/mL范围内，清除率随着质量浓度的增加而增大，在25 μg/mL时有最大清除率（893%），说明藜麦黄酮对DPPH·有很好的清除作用。

表6 藜麦黄酮对DPPH·的清除作用

藜麦黄酮质量浓度

（μg/mL） 清除率

（%）

5 22.8

10 39.7

15 56.8

20 79.3

25 89.3

30 89.3

2.7.2 藜麦黄酮对羟自由基（·OH）的清除作用 羟基自由基是一种化学性质极强的活性分子，也是危害最大的自由基之一。由表7可知，藜麦黄酮对羟自由基（·OH）清除效果明显，在5～25 μg/mL范围内，清除率随着质量浓度的增加而增大，当质量浓度达20 μg/mL时，清除率最大，说明藜麦黄酮对羟自由基（·OH）有很好的清除作用。

2.7.3 藜麦黄酮提取液对α-淀粉酶的抑制作用 分别取2、3、4 mL提取液， 计算抑制率。由表8可知， 藜麦黄酮提取

表7 藜麦黄酮对羟自由基（·OH）的清除作用

藜麦黄酮质量浓度

（μg/mL） 清除率

（%）

5 19.7

10 25.6

15 55.9

20 86.6

25 86.6

30 86.5

表8 藜麦黄酮提取液对α-淀粉酶的抑制作用

黄酮体积（mL） 抑制率（%）

2 37.26

2 37.93

3 32.14

3 29.41

3 33.33

4 41.38

液对α-淀粉酶有抑制作用，且其浓度与抑制率正相关。

3 结论

本试验研究了超声辅助法提取藜麦中黄酮的提取工艺，结果表明，超声波法的最佳提取条件为：料液比1 g ∶ 50 mL，乙醇浓度80%，提取温度50 ℃，提取时间30 min，超声功率240 W。藜麦黄酮对DPPH·、羟自由基（·OH）具有较强的清除作用。本试验证实了黄酮具有清除自由基、抗氧化的功效，是一种有效的自由基清除剂。

参考文献：

[1]万丽英. 苦荞麦的营养与开发应用前景[J]. 农业科技通讯，2010（9）：90-92.

[2]汤 容，樊瑞霞. 大豆异黄酮抗癌作用的研究进展[J]. 中国药学杂志，1999，34（7）：3-6.

[3]王文平，梁海玲，姚元华. 木瓜提取物中总黄酮含量的测定[J]. 贵州医药，2005，29（6）：546-548.

[4]薛 梅，黄国强，陈宏伟. 木瓜中总黄酮的提取及含量测定[J]. 淮海医药，2004，22（2）：156.

[5]吴 春，陈林林. 菟丝子黄酮体外清除自由基活性的研究[J]. 天然产物研究与开发，2005，17（5）：24-27.endprint