积雪草苷对人胃癌SGC-7901细胞株转移能力和凋亡影响*

康敏 任美萍 赵磊 邓明明 李昌平

(1.泸州医学院附属医院消化内科，四川 泸州 646000；2.泸州医学院药品与功能性食品中心，四川 泸州 646000；3.哈尔滨医科大学第二医院消化内科，黑龙江 哈尔滨 150081)

论 著

积雪草苷对人胃癌SGC-7901细胞株转移能力和凋亡影响*

康敏1任美萍2△赵磊3邓明明1李昌平1

(1.泸州医学院附属医院消化内科，四川 泸州 646000；2.泸州医学院药品与功能性食品中心，四川 泸州 646000；3.哈尔滨医科大学第二医院消化内科，黑龙江 哈尔滨 150081)

目的：观察积雪草苷对人胃癌SGC-7901细胞株转移能力和凋亡的影响。方法：采用细胞计数法(CCK-8)检测不同浓度的积雪草苷对人胃癌SGC-7901细胞株增殖影响；细胞黏附试验检测细胞体外黏附能力的变化，Transwell试验检测细胞体外侵袭能力的变化，流式细胞仪AnnexinV/PI双染法检测细胞凋亡率。结果：积雪草苷明显抑制人胃癌SGC-7901细胞株增殖，积雪草苷处理后人胃癌SGC-7901细胞株黏附能力分别下降到61.2%，47.6%，38.6%；侵袭能力分别下降到42.3%，31.7%，21.6%；AnnexinV/PI双染法检测显示积雪草苷可诱导人胃癌SGC-7901细胞株凋亡，与阴性对照组比较，差异有统计学意义(P<0.01)。结论：积雪草苷能抑制人胃癌SGC-7901细胞株的增殖，抑制其体外粘附和侵袭能力，诱导其凋亡。

积雪草苷；胃癌；凋亡；转移

胃癌是目前致死率位居所有肿瘤致死率第二位的恶性肿瘤，严重危害人类健康。胃癌可以通过手术药物治疗等方式进行治疗，但转移率高，胃癌死亡主要与胃癌转移有关，免疫应答、机体免疫功能下降，新血管增生等可能与肿瘤转移有关[1]。中药能提高机体免疫力，抑制肿瘤生长，能否从中药中寻找抑制肿瘤转移的有效药物是目前研究的一个方向。积雪草苷(Asiaticoside，AS)是从传统中草药积雪草中提取出的一种生物碱，以往研究主要集中在AS抗炎、抗氧化、抗衰老的治疗上[2]，目前研究显示积雪草苷也具有抗肿瘤活性，有学者发现积雪草苷对人肝癌细胞株，胃癌细胞株，S180等肿瘤均有诱导凋亡作用[3]。但目前积雪草苷对人胃癌细胞SGC-7901转移能力有无影响目前尚不清楚。据此本研究通过观察积雪草苷干预后对人胃癌细胞SGC-7901的浸润和粘附以及凋亡的影响，为积雪草苷用于防治胃癌提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 药品与试剂

积雪草苷(成都普斯生物科技有限公司，纯度98%，溶于DMSO中，终浓度低于1‰)；CCK-8试剂盒(碧云天生物技术研究所)；AnnexinV-FITC试剂盒(南京凯基生物科技发展有限公司，中国)；Transwell小室(Costar Cambridge公司，美国)；Matrigel胶(BD公司，美国)；人胃癌SGC-7901细胞株(上海拜力生物试剂有限公司，中国)。

1.2 仪器

CKX41型倒置相差显微镜(日本Olympus公司)；MCO-15A型CO2培养箱(日本Sanyo公司)；550型酶标仪(bio-rad，美国)；流式细胞仪(美国BD公司，SBK-YLQX-003552型)；SW-CJ-1F型)超净工作台(苏州净化设备有限公司)。

1.3 方法

1.3.1 CCK-8检测积雪草苷对人胃癌SGC-7901细胞株增殖的抑制作用

人胃癌SGC-7901细胞株采用含10%胎牛血清的RPMI1640培养基，在37℃、5%CO2条件下常规培养，实验取对数生长期的细胞。细胞常规胰酶消化后制成单细胞悬液，调整细胞数为(4～5)×107·L-1，细胞接种于96孔板中，每孔90 μl，在37℃、5%CO2条件下常规培养24 h，分别加入终浓度为400、200、100、50、25 μg·ml-1的积雪草苷，阴性对照组加入等体积的RPMI1640培养基继续培养48 h，随后每孔加入CCK8 10 μl继续培养1 h，酶标仪450 nm波长下检测各孔吸光度A值，计算细胞生长抑制率，细胞增殖抑制率=[1-A给药组-A空白孔)/(A阴性对照组-A空白孔)]×100%，Logit法计算半数抑制浓度(IC50)。

1.3.2 积雪草苷对人胃癌SGC-7901细胞株侵袭能力的影响

Transwell小室4℃预冷，将趋化因子人纤连蛋白(Fibronectin，FN)涂于小室下层，Matrigel胶包被于小室上层，37℃孵育1 h。根据1.3.1结果，选取积雪草苷干预浓度为200、100、50 μg·ml-1。将实验分为阴性对照组(培养基)，积雪草苷干预组(细胞+积雪草苷200、100、50 μg·ml-1)。实验步骤为先将对数生长期的人胃癌SGC-7901细胞株经不同浓度积雪草苷处理24 h，阴性对照组细胞正常培养不作处理。之后收集细胞，取5×105细胞悬浮于小室的上层，小室下方加人含0.1%BSA的培养基600 μl，37℃孵育24 h。经多聚甲醛固定，HE染色。每组4复孔，显微镜下选取5个视野计算穿过滤膜的细胞数，计算平均值。实验重复3次。

1.3.3 积雪草苷对人胃癌SGC-7901细胞株黏附能力的影响

将实验分为阴性对照组(培养基)，积雪草苷干预组(细胞+积雪草苷200、100、50 μg·ml-1)，每组4复孔。取对数生长期的人胃癌SGC-7901细胞株经不同浓度积雪草苷处理24 h后，收集细胞5×105每孔接种在铺有Matrigel胶的24孔板中，37℃孵育1 h，弃培养基，PBS洗3次，加入20 μlMTS，37℃孵育2 h。用酶标仪测定黏附在Matrigel胶上细胞的OD值(波长490 nm)。

1.3.4 流式细胞仪Annexin V-FITC/PI双染法检测细胞凋亡率

细胞以每孔5×105接种于6孔板，37℃、5%CO2培养箱培养24 h，加入终浓度分别为400、200、100、50、25 μg·ml-1的积雪草苷，阴性对照组加入等体积的RPMI1640培养基继续培养48 h，胰酶消化细胞收集于离心管，PBS洗涤一次后将细胞悬浮于100 μl PBS中，Annexin V-FITC/PI染色后流式细胞仪检测细胞凋亡率。

1.4 统计学方法

2 结果

2.1 积雪草苷对人胃癌SGC-7901细胞株增殖的抑制作用

积雪草苷可抑制人胃癌SGC-7901细胞株的增殖，且随着浓度增加抑制率增加，其IC50为238.98±2.45 μmol·L-1，浓度-抑制率见表1。

表1 积雪草苷对人胃癌SGC-7901细胞株增殖的抑制率

注：与空白组相比，*P<0.01。

2.2 积雪草苷对人胃癌SGC-7901细胞株黏附能力抑制作用

200、100、50 μg·ml-1积雪草苷干预后，人胃癌SGC-7901细胞株黏附能力分别是对照组的61.2%，47.6%，38.6%(P<0.01)，见图1。

图1 积雪草苷对人胃癌SGC-7901细胞株黏附能力抑制作用(n=4)

2.3 积雪草苷对人胃癌SGC-7901细胞株侵袭能力抑制作用

200、100、50 μg·ml-1积雪草苷干预后，人胃癌SGC-7901细胞株侵袭能力分别是对照组的42.3%，31.7%，21.6%(P<0.05)，见图2。

图2 积雪草苷对人胃癌SGC-7901细胞株黏附能力抑制作用(n=4)

2.4 流式细胞仪Annexin V-FITC/PI双染法检测细胞凋亡率

积雪草苷可诱导人胃癌SGC-7901细胞株凋亡，400、200、100、50、25 μg·ml-1凋亡率随浓度增加而增加，凋亡百分率分别为11.89%，13.49%，16.31%，17.2%，25.41%与阴性对照组比较，差异有统计学意义(P<0.01)，见图3，4。

(a)积雪草苷400 μg·ml-1组 (b)积雪草苷200 μg·ml-1组

(c)积雪草苷100 μg·ml-1组 (d)积雪草苷50 μg·ml-1组

(e)积雪草苷25 μg·ml-1组 (f)阴性对照组

图4 积雪草苷对人胃癌SGC-7901细胞株凋亡率影响

3 讨论

胃癌是我国最常见的恶性肿瘤之一，确诊时多已经出现转移，胃癌转移是胃癌最重要的恶性特征，也是导致患者死亡的最主要原因之一，目前尚缺乏有效治疗手段[4]。肿瘤转移是一个复杂的过程，包括肿瘤细胞脱离原发部位，穿越基质组织和血管壁，进入循环系统，形成远端转移[5]。细胞凋亡是一个受到严密调控的程序性细胞自杀过程，目前认凋亡在调控细胞增殖、肿瘤的形成和发展中起关键作用。由于肿瘤患者免疫能力的异常导致在恶性肿瘤发生和发展过程中细胞凋亡抑制导致肿瘤进一步生长，因此细胞凋亡抑制后比细胞过度增殖更重要[6]。治疗肿瘤的一大目的在于杀死肿瘤细胞，临床用的化疗、放疗和一些生物疗法的作用机制之一就是引发肿瘤细胞凋亡，因此通过诱导凋亡来治疗和预防肿瘤是一有效措施[7]。

积雪草苷作为积雪草内主要的活性成分，已有报道称能够诱导肿瘤细胞的凋亡，对肿瘤细胞增殖也有一定作用，但是积雪草苷对胃癌转移有无影响目前研究较少，因此我们考察了积雪草苷对胃癌细胞的增殖，转移以及凋亡情况，结果显示积雪草苷可抑制人胃癌SGC-7901细胞株的增殖，且随着浓度增加抑制率增加，其IC50为238.98±2.45 μmol·L-1，积雪草苷干预后人胃癌SGC-7901细胞株黏附能力和侵袭能力明显降低，同时积雪草苷可诱导人胃癌SGC-7901细胞株凋亡，提示积雪草苷在防止胃癌肿瘤转移上有一定作用，但其具体机制尚不清楚，值得进一步探讨。

1 Luo GQ, Li JH, Cao L, et al. Activator protein-1 involvement in proliferation inhibition by gene silencing of Twist in gastric cancer cells[J]. Pathology, 2011，43(7): 697-701.

2 Qiu J, Yu L, Zhang X, et al. Asiaticoside attenuates lipopolysaccharide-induced acute lung injury via down-regulation of NF-κB signaling pathway[J]. Int Immunopharmacol, 2015, 26(1): 181-187.

3 Al-Saeedi FJ. Study of the cytotoxicity of asiaticoside on rats and tumour cells[J]. BMC Cancer, 2014, 14: 220-233.

4 徐文杰,周建奖. 胃癌转移的研究进展[J]. 中华临床医师杂志(电子版), 2011, 5(1): 170-173.

5 袭燕,段瑞生,宋伟,等. 胃癌转移的免疫分子和基因研究进展[J]. 肿瘤防治杂志, 2002, 9(6): 649-652.

6 Sun J, Song Y, Wang Z, et al. Benefits of hyperthermic intraperitoneal chemotherapy for patients with serosal invasion in gastric cancer: a meta-analysis of the randomized controlled trials[J]. BMC Cancer, 2012, 12(5): 526-536.

7 Min YJ, Bang SJ, Shin JW, et al. Combination chemotherapy with 5-fluorouracil and heptaplatin as first-line treatment in patients with advanced gastric cancer[J]. J Korean Med Sci, 2004, 19(3): 369-373.

Effects of asiatiocoside on proliferation and apoptosis of SGC-7901 cells*

Kang Min1, Ren Mei-ping2, Zhao Lei3, Deng Ming-ming1, Li Chang-ping1

(1.Department of Gastroenterology, The Affiliated Hospital of Luzhou Medical College, Sichuan Luzhou 646000;2.Research Center for Drug and Functional Foods, Luzhou Medical College, Sichuan Luzhou 646000;3.Department of Gastroenterology, The Second Affiliated Hospital of Harbin Medical University, Heilongjiang Harbin 150081)

Objective：To investigate the effects of asiaticoside on proliferation and apoptosis of SGC-7901. Methods: Growth inhibition was measured by cell counting kit-8, the adhesion in vitro was detected by cell adhesion assay; the invasion in vitro was detected by transwell assay; the rate of apoptosis was detected by flow cytometry with Annexin-V/PI staining. Results: Asiaticoside inhibited the growth of SGC-7901 effectively. The adhesion of cells in vitro was decreased to 61.2% and 38.6% respectively; the invasion in vitro was decreased to 42.3% and 21.6%. Compared with the negative control group, the apoptosis of SGC-7901was significantly induced by different concentration of asiaticoside (P<0.01). Conclusion: Asiaticoside can inhibit the proliferation, induce apoptosis of SGC-7901 and inhibit the metastasis of SGC-7901 in vitro.

Asiaticoside; Gastric carcinoma; Apoptosis; Transfer

四川省卫生厅课题(编号：100282)

2015-4-24)

作者介绍：康敏，女，副教授，主要从事消化系统疾病研究，Email：354699170@qq.com。

Δ通讯作者：任美萍，女，讲师，主要从事药物分子机制研究，Email：meishanligang@163.com。