参附汤抗大鼠心肌缺血作用与apelin表达的相关性研究

刘 智,王健全,王星云,刘 畅,申丽雪,徐慧颖,张大方

(1.长春中医药大学，吉林 长春 130117；2.长春迪瑞医疗科技股份有限公司，吉林 长春 130000；3.修正集团长春高新制药有限公司，吉林 长春 130108)



参附汤抗大鼠心肌缺血作用与apelin表达的相关性研究

刘 智1,王健全1,王星云1,刘 畅2,申丽雪3,徐慧颖1,张大方1

(1.长春中医药大学，吉林 长春 130117；2.长春迪瑞医疗科技股份有限公司，吉林 长春 130000；3.修正集团长春高新制药有限公司，吉林 长春 130108)

目的 探讨参附汤对异丙肾上腺素(ISO)所致心肌缺血损伤大鼠的作用及apelin蛋白表达的变化对心肌缺血的影响。方法 采用皮下注射ISO方法建立心肌缺血动物模型。灌胃给予大鼠不同剂量的(3、6、12 g·kg-1)参附汤，模型组与空白组灌胃等体积蒸馏水，阳性组灌胃参附注射液6.67 g·kg-1，连续灌胃15 d；从d 11开始，灌胃1 h后，皮下多点注射ISO，连续5 d造模。造模后考察参附汤对心肌组织形态学、血清中心肌酶含量、心肌组织中apelin mRNA含量及血清中apelin蛋白含量的影响，并探讨心肌酶与apelin表达变化的相关性。结果 参附汤可以明显减轻心肌组织坏死程度；与模型组相比，参附汤中、高剂量组肌酸激酶(CK)值及各剂量组的乳酸脱氢酶(LDH)值均明显降低(P<0.05或P<0.01)；参附汤中、高剂量组大鼠血清apelin蛋白含量及心肌组织mRNA含量与模型组相比，均明显升高(P<0.05，P<0.01)；此外，血清apelin与心肌酶CK、LDH的表达呈负相关。结论 参附汤具有抗ISO所致大鼠心肌缺血作用，该作用机制与其促进apelin mRNA表达，使apelin蛋白含量增多，从而抑制心肌酶生成，改善心肌缺血有关。

参附汤；异丙肾上腺素；心肌缺血；肌酸激酶；乳酸脱氢酶；apelin

Apelin是一种心血管活性多肽，是由日本学者1998年利用反向药理学的方法从牛胃的分泌物中提取并纯化出的反义G蛋白偶联受体-血管紧张素受体AT1相关蛋白的天然配体[1]，其对多种因素所致的心脏损伤均有保护作用[2]。参附汤(shenfu soup,SF)是由人参、附子组成的经典名方，附子、人参相使配伍，可达到减毒增效的作用[3]。现代药理学研究表明，SF具有增加冠脉流量，提高超氧化物歧化酶活性，改善血流动力学，抵抗心肌受损等功效[4-7]。本文拟通过皮下多点注射ISO方法建立大鼠心肌缺血模型，测定心肌酶等含量变化及apelin表达情况，并通过相关性分析探讨SF抗心肌缺血时心肌酶与apelin表达变化的相关性，从而揭示SF抗大鼠心肌缺血损伤作用的相关机制，为临床用药提供理论和实验依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物 ♂ SD大鼠(180～200 g)，吉林大学基础医学院实验动物中心，合格证号：SCXK-(吉)2012-0003。

1.1.2 药品与试剂 ISO：上海科鉴生物科技有限公司，批号：100166-201204；CK、LDH检测试剂盒：南京建成生物工程研究所；apelin检测试剂盒：REF DRE21040 201304；Simply P总RNA提取试剂盒：杭州博日科技有限公司；Bio RT逆转录扩增试剂盒：杭州博日科技有限公司；SYBR GREEN PCR Master Mix试剂盒：杭州博日科技有限公司；参附注射液：雅安三九药业有限公司，批号120505；附子、人参购自于长春宏检药业，按附子 ∶人参(2 ∶1)的比例称取药材，常规煎煮浓缩并冻干备用。

1.1.3 仪器 BL-420生物信号采集系统：成都泰盟科技有限公司；新世纪T6紫外分光光度计：北京普析科技有限公司；Model 680酶标仪：美国伯乐；低温高速离心机：德国Eppendorf公司；Bio Spec-nano：日本岛津公司；实时荧光定量PCR仪：美国安捷伦公司。

1.2 方法

1.2.1 筛选动物及实验分组 将麻醉大鼠仰卧位固定于鼠板上，将针状电极插入四肢及胸前心尖搏动处皮下。记录胸前导联或Ⅱ导联心电图，观察是否正常，弃去ST段有异常变化者和心律失常者。取符合条件的大鼠60只，随机分为6组，每组各10只，分别为空白对照组(Sham)，模型组(Model)，参附注射液组(SF injection)，参附汤低、中、高剂量组，普食喂养，自由饮水。

1.2.2 造模及给药方法 空白对照组：灌胃蒸馏水；模型组：灌胃蒸馏水，并于实验d 11，灌胃后30 min立即腹腔注射2 mg·kg-1ISO，30 min后将大鼠放入冰水中游泳5 min；参附注射液口服组：6.67 mg·kg-1参附注射液灌胃，其他同模型组；参附汤低、中、高剂量组：3、6、12 g·kg-1参附汤灌胃，其他同模型组。各组大鼠于给药d 15后腹腔注射20%乌拉坦 5 mL·kg-1麻醉，采用BL-420生物信号采集系统测量各组大鼠的ST段心电。腹主动脉取血，3 000 r·min-1离心15 min，取上清，冻存备用；一部分心脏迅速放入液氮中冻存，一部分心脏放入福尔马林固定液中固定。

1.2.3 HE染色检测大鼠心肌组织形态学改变情况 腹腔注射20%乌拉坦5 mL·kg-1麻醉大鼠，取心脏，用预冷生理盐水冲洗干净，放入10%福尔马林中固定24 h，石蜡包埋标本，切片，行HE染色，Leica光学显微镜下观察心肌组织形态学情况。

1.2.4 血清相关蛋白含量检测 末次给ISO后24 h，麻醉大鼠，腹主动脉取血，肝素抗凝，3 000 r·min-1离心15 min，取上清，按照试剂盒说明书中操作方法检测血清CK、LDH及apelin含量。

1.2.5 Real-time RT-PCR检测心肌组织中apelin mRNA的表达 取冷冻心肌组织标本，按照Simply P总RNA提取试剂盒说明书提取总RNA；吸取1 μL总RNA用Bio Spec-nano检测浓度；按照两步法Bio RT逆转录扩增试剂盒说明书将RNA逆转录成cDNA；参照Bio Easy SYBR Green I Real Time PCR Kit Manual说明书，采用三步法程序进行荧光定量PCR扩增，94℃预变性2 min，94℃变性10 s，60℃退火15 s，72℃延伸30 s，共40个循环；最后72℃延伸10 min。在30℃～95℃区间内进行融解试验，并绘制融解度曲线，目标基因表达相对定量分析2-ΔΔCt法。

Tab 1 Primer pairs used in Real-time PCR

2 结果

2.1 行为学观察实验期间空白组大鼠活泼好动，毛发整齐有光泽，呈白色，不易脱落，抓取时主动逃避，反抗较剧；而模型组大鼠造模后活动较少，嗜睡，精神萎靡，毛色枯槁，多倒竖，易脱落，抓取时反抗较轻。

2.2 参附汤对大鼠心肌组织形态学的影响与空白组比较，各组大鼠心脏心内膜不同程度的呈弥漫性心肌组织坏死，炎症细胞浸润,纤维组织增生，以模型组最为严重，而各给药组坏死程度明显减小。见Fig 1。

2.2 参附汤对大鼠血清相关蛋白含量的影响与空白组相比，模型组大鼠CK、LDH值明显升高(P<0.01)，而apelin含量明显降低(P<0.01)。与模型组相比，参附注射液组、参附汤低、中、高剂量组CK值均有一定程度的降低，除参附汤低剂量组外，差异均具有统计学意义(P<0.05或P<0.01)；与模型组相比，各给药组LDH值均明显降低(P<0.05或P<0.01)；而参附注射液组、参附汤中、高剂量组中apelin含量与模型组相比，均明显升高(P<0.05或P<0.01)。见Tab 2。

Fig 1 Effects of Shenfu Soup administration on morphological changes in myocardial ischemia of rats A:Sham; B:Model; C:SF injection; D:SF 3 g·kg-1; E:SF 6 g·kg-1; F:SF 12 g·kg-1

GroupDosage/g·kg-1CK/U·L-1LDH/U·L-1apelin/ng·L-1Sham-73．15±4．30539．78±75．68887．12±104．31Model-94．75±3．78△△961．15±68．34△△341．17±35．21△△SFinjection6．6778．76±7．23∗∗687．22±90．86∗628．04±99．74∗∗SF389．11±3．8823．08±58．24∗∗459．12±83．56683．91±6．85∗700．70±119．62∗∗527．05±112．75∗1281．43±3．72∗∗727．52±72．47∗∗615．46±109．12∗∗

△△P<0.01vsSham;*P<0.05,**P<0.01vsmodel

2.3 给予参附汤后模型大鼠心肌酶与apelin含量变化的相关性分析血浆apelin与心肌酶CK、LDH的相关分析显示，apelin与CK、LDH呈负相关(r=-0.819和r=-0.794,P=0.000)，存在相关性。

2.4 参附汤对心肌缺血大鼠心肌组织中apelin mRNA表达的影响Real-time PCR检测结果显示，模型组大鼠心肌组织apelin mRNA明显下降(P<0.01)。参附注射液组和参附汤中、高剂量组均可以明显上调由ISO素所致的apelin mRNA下降(P<0.01)；参附汤低剂量组也有上调的趋势，但差异无统计学意义(P>0.05)。见Fig 2。

Fig 2 Effects of Shenfu soup on mRNA of apelin in cardiac tissue of myocardial ischemia rats (±s, n=3)

△△P<0.01vssham;**P<0.01vsmodel.

3 讨论

Apelin在体内分布广泛，中枢与外周组织均有不同水平的表达，尤其在不同组织血管的内皮细胞中均有表达，与心血管的发育和功能有关[8]。本实验结果显示，与空白组相比，模型组血浆apelin含量明显降低；同时，与模型组相比，各给药组大鼠血浆中apelin含量均有所升高，其中参附注射液组、参附汤中、高剂量组中apelin含量与模型组相比，明显升高。以上结果提示参附汤可能通过影响apelin水平改善缺血心肌血管舒缩功能，从而发挥抗心肌缺血损伤作用。

CK、LDH等酶广泛存在在心肌组织细胞中，在维持心肌正常生理功能方面发挥着重要的生理作用[9]，血清中CK、LDH值在正常情况下要比组织中低1000倍左右[10]。研究表明，心肌缺血后代谢紊乱，心肌组织严重损伤，各种酶被释放出来，其中血清CK、LDH 含量明显增加，其升高程度与心肌梗死程度相平行且有加重缺血对心肌的损伤作用[10-13]。在本研究中，模型组大鼠血清中 CK、LDH 含量明显升高，说明心肌细胞受损；此外，各给药组可明显降低急性心肌缺血大鼠血清中CK、LDH含量，表明参附汤能够加强对心肌缺血时氧自由基的清除能力，增强心肌细胞有氧代谢，减轻心肌细胞变性及心肌组织的损害。同时，相关性分析结果显示，血浆apelin含量与心肌酶CK、LDH含量存在相关性。由此推测，参附汤抗心肌缺血损伤的机制可能与其明显增加apelin表达，进而降低心肌酶CK、LDH表达作用密切相关。

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Protective effect of Shenfu soup on myocardial ischemia in rats and expression of apelin

LIU Zhi1,WANG Jian-quan1, WANG Xing-yun1, LIU Chang2, SHEN Li-xue3, XU Hui-ying1, ZHANG Da-fang1

(1.ChangchunUniversityofChineseMedicine,Changchun,130117，China; 2.ChangchunDiruiMedicalTechnologyCo.,Changchun130000,China; 3.ChangchunGaoxinPharmaceuticalCo.ofXiuzhengPharmaceuticalGroup,Changchun130108,China)

Aim To study the effects of Shenfu soup on the ISO-induced myocardial ischemia injury model of rats and the influence of apelin level changes on myocardial ischemia. Methods The myocardial ischemia injury model of rats was established by the subcutaneous injection of ISO. For 15 days, rats in Shenfu groups were given by gavage 3, 6 and 12 g·kg-1Shenfu soup and rats in SF injection group were given 6.67 g·kg-1Shenfu injection, rats in sham group and model group were given the same volume of distilled water. Rats were subcutaneously multi-point injected ISO for 5 days on the eleventh administrating day. The effects of Shenfu soup on myocardial morphology, serum myocardial enzyme levels, apelin mRNA level in serum and apelin protein level in myocardial tissue, and relationship between myocardial enzyme and apelin expression were evaluated. Results Shenfu soup could reduce the degree of myocardial tissue necrosis and compared with model group, CK values and LDH values of rats in middle-and high-dose groups were significantly lower (P<0.05 orP<0.01). However, the apelin mRNA level in myocardial tissue and apelin protein level in serum of the rats in middle- and high-dose groups compared with model group had increased (P<0.05,P<0.01). Meanwhile, serum levels of apelin and the expression of myocardial enzyme CK and LDH were negatively correlated. Conclusion Shenfu soup has a protective effect on myocardial ischemia injury in rats induced by ISO and the mechanism is involved with the promotion of apelin mRNA and protein expression, the inhibition of myocardial enzyme production and the improvement of myocardial ischemia.

Shenfu soup; ISO; myocardial ischemia; CK; LDH; apelin

时间：2015-11-24 11:00 网络出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/34.1086.R.20151124.1100.052.html

2015-08-11,

2015-09-22

国家自然科学基金资助项目(No 81173597/H2809)；高等学校博士学科点专项科研基金新教师类(No 20122227120003)，国家级大学生创新创业训练计划(No 201410199005)；吉林省中医药管理局科研项目(No 2014-Q21)

刘 智(1978-)，女，博士，副教授，研究方向：中药复方药效作用物质基础及机制,E-mail：54876760@qq.com; 王星云(1964-)，女，讲师，研究方向：医学统计学与流行病学，通讯作者，E-mail：970975718@qq.com

10.3969/j.issn.1001-1978.2015.12.026

A

1001-1978(2015)12-1760-04

R-332；R289.5；R322.11；R542.202.2；R977.3；R977.6