脊髓室管膜细胞再生修复的潜力和其他相关细胞靶向治疗策略

魏子淳 王宇 徐熙萌 吴畏 饶晨旭 谭会兵

脊髓室管膜细胞再生修复的潜力和其他相关细胞靶向治疗策略

魏子淳 王宇 徐熙萌 吴畏 饶晨旭 谭会兵

中枢神经系统中，脊髓中央管室管膜细胞(EC)具有一定的再生修复能力，是特化的不仅限于功能形态学的活性单位，后者作为特定的术语，它的意义超出生理学和解剖学定义。在损伤条件下，EC即可增殖分化为星形胶质细胞、少突胶质细胞和神经元。目前，复合生长因子和纤维蛋白支架的干细胞实验性治疗研究还存在长期疗效的争议。在中枢神经系统原位，使非神经元直接转化为功能性神经元研究方法，为脊髓损伤和疾病提供了新的治疗策略。在设计细胞治疗，如何控制EC增殖和分化或其他非神经元转化为神经元，继而形成和维持稳定有效的新生神经元功能，直至脊髓功能恢复仍然需要继续深入研究。我们需要一个全新的细胞组织概念，将神经干细胞栖地应用于中枢神经损伤等疾病的治疗和修复研究中，建立非传统的细胞分化和成熟的生物医疗微生态即环境再造治疗策略。

脊髓；干细胞；室管膜细胞；脊髓损伤；治疗

长期以来人们认为哺乳动物中枢神经组织为终极分化的恒久组织，缺乏自我更新和修复能力。即使已经发现在室管膜及其脑室下层(subventricular zone，SVZ)和海马齿状回颗粒下层存在神经干细胞，然而在损伤和疾病条件下，其再生和修复能力极其有限。仅美国每年就有1.2万人因脊髓损伤造成永久性残疾[1]。为弥补这种修复能力的缺陷，正在开辟的神经干细胞移植作为治疗中枢神经系统(CNS)损伤以及神经退行性疾病的一种新型治疗策略，引起广泛的注目。

一、脊髓中央管和功能形态学

首先，讨论一个名词术语：脊髓内的神经干细胞Niche (栖地)。Niche是研究干细胞的专业术语，其中文翻译还没有统一的共识，通俗科普定义可见生命百科(baike.bbioo. com)，有将niche翻译成“干细胞壁龛”提法，有关定义可参考Wikipedia；也有直接使用英文单词而不经翻译，比如“脊髓神经干细胞niche的研究进展”[2]，因为niche词语还是关联生态环境方面术语。本文将niche暂时翻译为“栖地”，Nature对niche定义如下：干细胞群建立在干细胞栖地(stem-cell niche，SCN)内，其关于参与如何调解组织发生，维持和修复的特殊解剖学部位。SCN维持干细胞免于枯竭，同时保证宿主避免干细胞增殖过度活跃。SCN构建基本组织生理学单位，整合信号介导干细胞对机体需要的平衡反应。对SCN干细胞或其他靶点施以异常功能可发生病理改变。干细胞及其SCN之间的相互作用是维护组织建立动态系统和最终设计干细胞治疗所必须的。干细胞的简单解剖学位置不足以完整定义SCN，SCN兼备解剖和功能两维性[3]。

在胚胎发育时外胚层和神经上皮发育成神经管，其头侧先形成脑泡，继而形成前脑和脑室系统，尾侧在脊髓形成中央管。室管膜细胞(ependymal cell，EC)是衬在脑室和中央管内表面的上皮样的细胞。游离面的纤毛形成二维极性，纤毛搏动能够驱动脑脊液流动。脑脊髓损伤可致室管膜的纤毛搏动障碍。二维细胞极性(planar cell polarity，PCP)是EC功能基础，有一系列发育分子机制控制[4]。在中央管腔内有Reissner's纤维(RF)，是紧凑束状结构，由非条纹组成的丝状纤维，其直径约5～10 nm。中央管内还有上述EC的纤毛，通常可单个散置，也可多到4条，多数为2条深入到管腔内[5]。

灵长类Macaca fascicularis的脊髓中央管可由无纤毛、单纤毛、双纤毛和多纤毛EC，胶质细胞和神经元组成。多纤毛细胞类似于侧脑室EC，单纤毛和双纤毛细胞呈大的星形基底细胞，类似于鼠类EC。可以观察到单纤毛和双纤毛细胞而不是多纤毛细胞可增殖产生新的EC。人类婴儿期和成年脊髓的EC类型和猴子相似。此外，在中央管周围还可发现由中间丝构成的纤维束[6]。

纤毛可分为两类，初纤毛和动纤毛，他们通过基部胞体长轴的转动和基部胞体与顶部胞体翻转位控制EC的极化发育[7]。无论是动纤毛还是初纤毛，其动力障碍均可导致脑积水[8-9]。电子显微镜观察，经[3H]噻嘧啶和BrdU标记，可以发现EC分裂现象。大多数的EC具有两个长的9+2结构的动纤毛，呈抗原标记vimentin，CD24，FoxJ1，Sox2和CD133阳性，然而nestin和神经胶质纤维酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein，GFAP)阴性。双纤毛EC类似侧脑室E2细胞，但是细胞基底部却不像E2或E1细胞。有趣的是，有些细胞有两个核、4条纤毛，很像不完全的胞质分裂或细胞融合[10]。

RF是由联合下器(subcommissural organ，SCO)分泌的糖蛋白聚集形成，RF占据脑室导管和中央管，可以一直向脊髓中央管下端延续。牛和鸡的RF含有540 kDa前体蛋白，牛还有320 kDa的前体蛋白，RF由两个不同的复合体组成，一个预计分子量约700 kDa，另一个至少由6个多肽组成。现在有5个cDNA序列编码SCO-脊椎样蛋白[11]。七鳃鳗完全性脊髓损伤不影响RF产生，RF物质堆积在脊髓损伤近端。GAP-43抗体反应可标记损伤动物的SCO和RF，但是western blotting不能标记预计出现GAP-43蛋白反应的条带，5-HT抗体也不能标记[12]。

脊髓中央管与脑室EC是有区别的，在中央管室管膜下层有一些特征不清晰的胶质细胞构成边界，结构也相对不完善，还有少量的胶质细胞，少突胶质细胞和神经元组成。不像脑室SVZ，围绕中央管的增殖细胞靠近血管，主要涉及室管膜，而室管膜下细胞不明显。这些细胞以典型的自我复制方式增殖而不是产生转化放大祖细胞，并且没有发现亚类EC存在细胞系关联的证据。中央管背侧极存在伸长细胞样亚群，表达EC和神经元前体两者细胞的标志物[13]。脊髓中央管由EC、伸长细胞、胶质细胞等组成，还包括接触脑脊液神经元等细胞(图1)。该图以Hugnot示意图(2011)[14]为基本模式，我们再总结文献绘制。

图1 脊髓中央管示意图(参照Hugnot[14]文献重新绘制)

研究EC及其相关细胞常用的生物标志物有nestin、vimentin和SOX2等80多种，EC有增殖潜力，Ki67是一种增殖细胞相关的核抗原，其功能与有丝分裂密切相关，出现于细胞增殖过程中，Ki67作为标记细胞增殖状态的标记物[14]。新的标志物还在不断的发现，比如最近还发现在大鼠脊髓内ATF3是一种新型核标志物用来定位EC迁移[15]。在生物体内，脊椎中的Olig2阳性运动神经元祖细胞可能并不具有干细胞的特质。早期小鼠胚胎(E9.5)的运动神经元祖细胞移植到鸡胚(E2)后，祖细胞只会分化成运动神经元。相反地，移植晚期老鼠胚胎(E13.5)的运动神经元祖细胞移植到鸡胚后，却只能分化成寡突细胞，无法分化成运动神经元[16]。

二、EC对SCI和疾病反应

人体的病理学研究证实脊髓损伤增加nestin阳性细胞EC，增生细胞反应是跨节段，可见于颈段、胸段和腰段，说明局部的损伤累及全部脊髓的干细胞栖地反应，增殖细胞的nestin与GFAP染色没有交叉免疫反应[17]。

新近的研究指出，大鼠脊髓中央管细胞可以进一步根据表达受体分成独特的亚细胞群，比如CB1大麻素受体EC，这些细胞分布在中央管背侧和两侧，细胞呈卵圆性核为尖锥型，纤毛数量不等(0.1或2个)；同样这些细胞表达干/祖细胞标志物，比如Vimentin，Nestin，Sox2，Sox9和GLAST，但CD15和GFAP阴性。静息状态EC不增殖，刚出生和钝性脊髓损伤50%EC表达Ki67[18]。对于脊髓EC的分化潜力，应用3种实验模型对比，只有钝性SCI可以诱发脊髓EC增殖，而溶血磷脂酰胆碱脊髓内局部注射和脱髓鞘疾病多发性硬化模型均不能诱发EC[19]。人类EC也同样具有分化潜力，保存良好无病理表现的成年人体尸检脊髓标本可以发现nestin，Sox2、GFAP、CD15、Nkx6.1和PSA-NCAM表达。电镜观察可以发现室管膜靠近室管膜外侧有未成熟的细胞。从人体脊髓完全分离的细胞经培养，神经球中可见Sox2(+)nestin (+)的增殖前体细胞，这些细胞可进一步分化成胶质细胞和GABA能神经元[20]。

为研究神经前体细胞(neural precursor cells，NPCs)在脊髓内的分布，应用nestin第二内含子增强子控制的LacZ报告基因显示nestin阳性表达细胞。发现背角阳性细胞＞中央管区＞前角，在背角主要分布在胶状质，中央管区主要分布在室管膜，从脊髓节段上分，颈段＞腰骶＞胸段。左右侧没有区别，在相应的颈段、腰骶、胸段内也无区别[21]。小剂量的脂多糖有可能促进肠道或SVZ来源的神经干细胞分裂，高剂量则对神经干细胞有抑制作用[22]。宋启春等[23]也发现大鼠脊髓内室管膜区细胞，在钝性打击损伤后潜在的增殖和分化能力能可被激活，半乳凝素-1对室管膜区细胞的增殖和分化具有明显促进作用。狗损伤后，应用免疫组化显示(proliferating cell nuclear antigen，PCNA)，Ki-67，caspase 3，E-cadherin，GFAP和vimentin时，对照组与损伤组均未见Ki-67表达，可能是犬类有一定种属差异，损伤可致GFAP阳性细胞增加[24]。即便是较轻微的脊髓损伤，也可以使EC在脊髓损伤3 d之后，开始增殖，而不出现细胞凋亡。表现为nestin迅速表达，增值标记指数达8.6倍；而且阳性细胞向损伤部位迁移，增殖的EC可以分化为胶质细胞[25]。更重要的是，脊髓损伤引起的EC增殖，不仅是限于损伤相邻的局部，而是其他非创伤部位脊髓也有增生细胞核抗体PCNA、nestin、GFAP和GAP-43免疫阳性反应[26]。

增生的EC从室管膜处开始迁移，移向靠近轴突围绕在血管周围的空间，损伤尾侧端的中央管6周时开始扩大。扩大的管腔内衬的中央管内侧EC的高度变短。可见成簇的异位EC与扩大管腔有关。距离中央管较远的EC有形成玫瑰花环样地趋势。在EC簇之间可见3～8个神经纤维组成束状结构[27]。不能只看到SCI修复中胶质细胞的劣势，胶质细胞实际上在减轻损伤范围、清除毒素、维持微环境稳定方面起着重要的作用[28]。

三、SCI干细胞治疗

内源性干细胞在治疗SCI方面可以避免免疫排斥反应，近年来亦受到重视[29-31]。妊娠期间胚胎和早产儿脊髓存在干细胞，其分化潜能可能区别不大。正常情况下，nestin不表达，但是在肌萎缩侧索硬化和脊髓肿瘤患者可以见到阳性表达。这说明在疾病在疾病条件下，尤其是患肿瘤时，激发机体的抗病机制[32]。人类的脐带间充质干细胞可以促使钝性打击脊髓损伤大鼠脊髓中央管EC增殖，创伤空腔明显变小，运动功能明显恢复。BrdU细胞有nestin、NG2、CNPase、MBP和GFAP阳性表达[30]。

表皮生长因子(EGF)和成纤维细胞生长因子2(FGF2)可使在体的成年大鼠脊髓室管膜前体细胞增殖分裂[33]。脑室下分离的多能干细胞是EGF依赖性，腰骶脊髓多能干细胞为EGF+碱性FGF依赖性[34]。最近有证据表明，通过BrdU免疫标记，神经祖细胞Ki67、Nanog、Nestin和Sox-2标记经体视学分析，损伤后背根神经节有神经发生[35]。背根神经节实际上是中枢神经系统内的结构，因为解剖学上，背根神经节位于脑脊膜内，周围包围着脑脊液。与中枢神经损伤不同，周围神经损伤一般是可以通过轴突生长锥沿雪旺氏细胞鞘再生至靶器官[36-37]。

脊髓损伤治疗要本着构建SCN要素，注重细胞发育环境动态平衡稳态，形成一个解剖和功能交互作用的整体行动。SCI治疗，无论是干细胞注射植入，诱导脊髓内源性干细胞，还是转化胶质细胞使其成为神经元细胞，最终使得SCI病灶两侧上行和下行神经元连接起来，而不仅仅是长距离跨越胶质瘢痕。显然单纯的干细胞在治疗SCI不能达到理想的效果，干细胞借助纤维蛋白支架再复合多种生长因子还是可以达到这一目的[31]。虽然干细胞治疗研究取得一定的进展，但是这些实验结果并不相一致。最近一项类似上述干细胞附加纤维蛋白复合生长因子的动物实验，重新评价了脊髓损伤治疗，其疗效表明，T3水平脊髓横断两周后，开始这种综合性移植治疗9周后，虽然从网状结构神经追踪可以显示红核脊髓束，干细胞移植物可以充满损伤病灶空腔，并有大量轴突生长，但是BBB评分的结果显示移植组和对照组的运动恢复没有区别[38]。除了急性SCI病人，现在SCI很多是慢性的，上述两个实验表明，同样移植神经干细胞，保证新生神经纤维稳定地跨越胶质瘢痕达到功能性环路建立还需要进一步验证，因为神经元可以在相应各种生长因子诱导下，生长入相应的区域，但是如果建立不了稳定的生理环路机能联系和或投射支配，这些新生的神经终末有可能最终退化，甚至源于治疗的神经元胞体也会随后死亡。

发掘自身抗病因素也是需要考虑的因素，除了损伤可激发EC增生以外，通过观察Sox-2、nestin、Ki67和BrdU，生理锻炼也可增加脊髓干细胞数量；给脊髓损伤大鼠，辅助跑步机锻炼可以促进自主排尿功能和改善运动[39]。这种改善可能是增加了新生或脱髓鞘纤维髓鞘化而提高了功能恢复[40]。

四、原位内源性非神经细胞转化功能性神经元

人类胚胎干细胞移植存在伦理学问题，还有异体来源的细胞还有免疫排斥问题[41]。因此，在中枢神经系统内，在基因表达水平，将常驻非神经元细胞重新编程，刺激自身细胞增殖或诱导非神经元转化成神经元，有可能成为一种新的治疗途径。脊髓中央管的EC也可能成为神经干细胞的来源。很有趣的是，目前原位将非转化神经细胞转化为神经元，转化靶细胞可以不限于EC，而是脑或脊髓的胶质细胞和由于病理刺激引起的反应性胶质细胞。

当神经退行性变或神经损伤引起的反应性胶质细胞瘤或瘢痕时，用现有的方法很难逆转。应用逆转录病毒表达单一的神经转录因子NeuroD1可将上述病理条件下的胶质细胞转化为有功能的神经元。在表达NeuroD1后，再将胶质细胞转化成谷氨酸能神经元。随后NG2细胞再程序化为谷氨酸能神经元和GABA能神经元。在这些转化的神经元可记录到整合性的神经元功能活动。由此建立起来的转化系统，也可在培养体系中验证。现在，体外实验可以定向地控制出生后的哺乳动物中枢神经组织中的胶质细胞定向分化成为实验性治疗的移植神经元，这些神经元继而发育成具有突触联系的神经元，即胶质细胞转成功能性神经元。应用逆转录病毒载体。表达背侧端脑命运决定“Neurogenin2”转录因子可使星形胶质细胞转变为谷氨酸能神经元，相反表达腹侧端脑命运决定“Dlx2”转录因子可使其转变为抑制性GABA能神经元。Dlx2介导的神经元重编程效力远低于Neurogenin2，可能由于皮层星形胶质细胞对背侧端脑命运决定有高度的竞争性。有趣的是，当星形胶质细胞作为神经球细胞开始扩增时优先以Dlx2转化，重新编程使星形胶质细胞定向生成GABA能神经元的方向大为强化。更重要的是，在神经球阶段扩增使用的方法，随后程控定向的神经转化因子也能扩展地应用到损伤皮层中分离的活化星形胶质细胞，继而再选择性地产生谷氨酸能或GABA能神经元。

进一步从胶质细胞订制神经元来代替退行性变的神经元，并且还能定制含有特定递质的神经元。同样强制少突胶质细胞前体细胞表达Sox10、Olig2和Zfp536转录因子，也可以定制少突胶质细胞用于某些疾病治疗。因为少突胶质细胞是SCI功能修复较重要的作用。脊髓损伤时，可通过单一转录因子SOX2便可将常驻脊髓胶质细胞转化成微管相关蛋白doublecortin阳性的神经母细胞。转化的神经母细胞可在体内形成突触整合到神经回路中，应用组蛋白脱乙酰酶抑制剂，丙戊酸能够进一步促进神经元成熟过程。组织自我更新是正常的生理现象，由于中枢神经系统再生能力有限，如何利用和发掘脊髓的自己我更新和再生修复能力对治疗脊髓损伤和退行性神经疾病具有重要意义。众所周知，SCI伴随胶质瘢痕形成。在SCI修复中，EC具有正面和负面的作用。研究显示负面效果可能是阻碍损伤修复重要因素，因为胶质瘢痕中的星形胶质细胞超过半数来自EC，因此限制和干预EC损伤后的反应和增殖分化方向可能会影响SCI的治疗效果。研究斑马鱼SCI时可以发现有两种神经干细胞，一种是放射状胶质细胞表达同源盒转录因子Dbx，另一种缺乏Dbx但是表达Olig2。另外，新技术如活细胞成像，双光子复合共聚焦显微镜技术，展示4D数据揭示放射性胶质细胞和神经祖细胞的发育，对未来深入研究带来新的认识。

应该注意到研究神经干细胞需要面对非传统上的细胞和组织概念，就是前面提到的神经干细胞栖地，在体内外建立非传统的利于细胞分化和成熟的生物医疗微生态即环境再造治疗策略。EC可以分化为多种中枢神经细胞，无论是星形胶质细胞，少突胶质细胞还是神经元，最终还是解决神经元的功能修复，现在需要进一步了解SCI修复时各种细胞扮演的角色，开展必要的比较动物学研究，比如两栖类动物脊髓损伤能够完全功能恢复。深入研究低等动物两栖类动物脊髓损伤功能恢复的奥秘，也可能从中找到一些答案。

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Potential of spinal cord ependymal cells reproduction and other related cell targeted therapeutic strategies

Wei Zichun,Wang Yu,Xu Ximeng,Wu Wei,Rao Chenxu,Tan Huibing.
Department of Anatomy,Liaoning Medical College,Jinzhou 121001,China

Huibing Tan,Email:davidtanhb@foxmail.com

In the central nervous system,the ependymal cells(EC)in central canal of the spinal cord remain the persistence of a pool of stem and progenitor cells.Terminology of the EC niche as an entity of action not only showed neural stem cell potential but functioned beyond physiological and anatomical manners.The spinal cord EC generated astrocytes,oligodendrocytes and neurons in vitro and in vivo in injured spinal cord.However,it was still a challenge that the long term survival of spinal cord injury(SCI)treated by the stem cells transplanted in a fibrin matrix with a growth factor cocktail. Recently,the non-neuronal cells were directly converted into functional neurons in vivo,which opened up a new cellular therapy.With ultimate design of the therapeutics,we still need further to investigate how to manipulation of the proliferation and differentiation of EC or reprogramming of non-neuronal components into neuronal compartments，and constitute and functionally sustain the transplantation of stem cells and cellular modification in vivo until functional recovery in following SCI.We should figure out a new concept other than the traditional cell and tissue,stem cell niche,which could be non-traditionally mimicked in our human bodies to treatment of SCI under biomedical micro-ecology.

Spinal cord;Stem cell;Ependymal cell;Spinal cord injury;Treatment

2015-04-08)

(本文编辑：张丽)

10.3877/cma.j.issn.2095-9141.2015.03.013

辽宁医学院人才引进项目(YY017)；国家自然科学金(81471286)；辽宁省大学生创新课题(201410160007)；辽宁医学院教改课题(YA2014004)资助

121001锦州，辽宁医学院解剖学教研室

谭会兵，Email：davidtanhb@foxmail.com

魏子淳,王宇,徐熙萌,等.脊髓室管膜细胞再生修复的潜力和其他相关细胞靶向治疗策略[J/CD].中华神经创伤外科电子杂志,2015,1(3):178-182.