体外添加不同水平硝酸盐对绵羊瘤胃干物质消化率的影响

路佩瑶，曹宁贤，王福传，宋献艺，张 凯

（1.山西省农业科学院饲料兽药研究所，太原 030031；2.山西省畜禽繁育工作站，太原 030001）

反刍动物排放的甲烷是饲料在瘤胃内发酵所产生的，是一种高能物质。甲烷的生成是反刍动物维持其瘤胃微生态平衡的有效机制。甲烷主要在反刍动物瘤胃和后肠道内产生，是甲烷菌利用氢、二氧化碳和乙酸等物质为底物经过酶促反应后的产物。甲烷菌主要游离于瘤胃液或吸附在原虫表面以及胞液内，其利用纤维分解菌产生的氢等底物合成甲烷，并主要以嗳气的形式排出体外，这对降低瘤胃内的氢分压起着重要作用，因此甲烷菌与其他微生物紧密联系共同维持着瘤胃内稳定的微生态内环境的稳定[1]。

研究表明，甲烷所消耗的能量约占饲料可消化能的6%～12%，低质粗饲料可达15%，也就是说反刍动物在消化过程中有20%能量转化成甲烷浪费掉。瘤胃中甲烷的产生既造成能量损失，又加剧温室效应，然而其对反刍动物是有益的。如何在降低甲烷生成的同时又不影响动物的健康和生产性能，达到环境和经济的双重效益，是目前研究的重点。

研究证明，通过添加硝酸盐改变电子受体，使电子流向甲烷生成菌之外的微生物，促进硝酸盐还原菌在瘤胃内的生长发育，使这些还原菌与甲烷生成菌竞争氢原子而达到抑制甲烷产生的目的[2]。但是当瘤胃中硝酸盐添加过量时，硝酸盐可被还原生成亚硝酸盐，有可能引起亚硝酸盐中毒，而且硝酸盐本身还是很强的血管收缩剂，另外大量的硝酸盐会降低反刍动物的采食量[3]。因此，本试验采用体外产气量法，研究瘤胃微生物适应硝酸盐前后，添加不同剂量硝酸盐对瘤胃干物质消化率的影响，探讨是否可以通过逐渐饲喂的方法使瘤胃微生物适应硝酸盐，且不影响瘤胃对营养物质的消化。

1 材料和方法

1.1 试验动物及饲养

试验动物由山西省农业科学院饲料兽药研究所养殖基地提供。选用健康的、装有永久性瘤胃瘘管的晋中羯羊6只为试验动物。随机分为2组，对照组绵羊不饲喂硝酸盐，以尿素加豆粕为氮源，作为研究瘤胃微生物未适应硝酸盐时的瘤胃液供体动物。试验组绵羊用KNO3逐渐代替尿素氮，直到KNO3的喂量达到日粮干物质的2.27%，待动物适应硝酸盐1周后，作为研究瘤胃微生物适应硝酸盐时的瘤胃液供体动物。

1.2 试验基础日粮

试验基础日粮精粗饲料比例为30∶70，精饲料为混合精饲料，粗饲料为羊草。每天7:00和19:00饲喂两次，基础日粮组成及营养水平见表1。

表1 基础日粮组成及营养水平

1.3 活体外人工瘤胃产气量试验

活体外人工瘤胃产气量试验参照Menke等建立的体外产气法进行[4]。该法测得的200mg饲料干物质24 h产气量与绵羊活体内有机物质消化率之间具有高度正相关[5]。试验底物以可溶性淀粉和纤维素为碳源，添加量分别为0.16和0.24 g；以KNO3作为唯一氮源，添加量分别为0.0032、0.0064和0.0134 g（NO3-N的含量分别为0.25%、0.50%和2.0%），将不同添加量的KNO3均匀地混入400mg底物中，每个处理3个重复，并设3个空白对照。晨饲前分别采集A组和B组瘤胃内容物，分别用4层纱布过滤，过滤后的瘤胃液与缓冲液配制为1∶2的混合培养液。将60 mL混合培养液加入到预热的盛有底物的培养瓶中39℃培养。

1.3.1 体外培养缓冲液的配制

试验所用缓冲液按照Russell和Jeraci方法配制[6]。

微量元素溶液（A）：每100 mL蒸馏水中含Ca⁃Cl2·2H2O 13.2 g、MnCl2· 4H2O 10 g、CoCl· 6H2O 1.0 g、FeCl3· 6H2O 8.0 g。

缓冲溶液（B）：将NH4HCO34.0 g和NaHCO335.0 g溶于蒸馏水，最后定容至1000 mL。

常量元素溶液（C）：Na2HPO45.7 g、K2HPO46.2 g、MgSO4·7H2O 0.6 g溶于蒸馏水，最后定容至1000 mL。

刃天青溶液：浓度为0.1%的刃天青溶液（m/V，厌氧指示剂，煮沸后有游离氧存在时呈红色，无氧时呈无色）。

还原液溶液：NaOH 160mg和Na2S·9H2O 625mg溶于100 mL蒸馏水（使用时临时配制）。

1.3.2 人工瘤胃营养液的准备

按照上述顺序和比例配制瘤胃微生物缓冲液：蒸馏水400 mL+溶液A 0.1 mL+溶液B 200 mL+溶液C 200 mL+刃天青溶液1 mL+还原剂溶液40 mL，加入刃天青溶液后混合液变为红色，通入无氧CO2并预热至39℃后约30 min，混合液颜色变淡或无色。在与过滤瘤胃液混合之前加入还原剂并通CO2气体使溶液褪至完全无色。

1.3.3 人工瘤胃培养液的配制

在晨饲前用导管经瘤胃瘘管真空抽取至少2只羊的瘤胃内容物置于预热至39℃的保温瓶中，混合均匀后经4层纱布过滤，量取所需体积（瘤胃液与人工瘤胃营养液的体积比为1∶2）的瘤胃液迅速加入到准备好的人工瘤胃营养液中，制成混合人工瘤胃培养液。混合人工瘤胃培养液边加热边用磁力搅拌器搅拌，同时通入无氧CO2[7]。

1.3.4 加样和培养

用自动加液器向每个培养瓶中分别加入上述混合培养液60 mL。同时做3个空白（只有培养液而没有底物）。将培养瓶迅速放入已预热（39℃）的水浴箱中，待加液完毕后成批转入人工瘤胃培养箱中培养，摇动1次·h-1[8]。

1.3.5 样品采集

在体外培养至24 h时，将培养瓶分别取出放入冰水浴中使其发酵停止，洗涤培养管瓶中的残渣并将其与对应样品离心所得沉淀一起用蒸馏水悬浮，再离心，重复两次后在105℃烘干12～24 h，称重并计算样品干物质消化率。

1.3.6 统计分析

试验数据采用SAS（Statistical Analysis System）的ANOVA方法进行统计分析，用Duncan's方法进行显著性分析，结果以“平均值±标准误”表示。样本干物质消化率计算公式见式1。

瘤胃内干物质分解常数以Marquardt的方法为基础，根据SAS的非线性回归方式按下列公式测定出a、b、c的值[9]。瘤胃内不同时间的干物质降解率适合方程见式2。

式中，P为t时间营养物质小时率；a为快速降解部分（%）；b为慢速降解部分（%）；c为b的降解常数；t为待测饲料在瘤胃中滞留的时间（h）。

2 试验结果

瘤胃微生物适应硝酸盐前后添加不同剂量硝酸盐对干物质消化率的影响见表2。

表2 瘤胃微生物适应硝酸盐前后添加不同剂量硝酸盐对干物质消化率的影响%

由表2可知，瘤胃微生物未适应硝酸盐时，低NO3组与中NO3组、高NO3组干物质消化率差异显著（P＜0.05），中NO3组和高NO3组差异不显著（P＞0.05）。瘤胃微生物已适应硝酸盐时，低NO3组与中NO3组、高NO3组干物质消化率差异不显著（P＞0.05），中NO3组和高NO3组差异不显著（P＞0.05）。瘤胃微生物未适应硝酸盐时，对照组与低NO3组间差异显著（P＜0.05），与中NO3组、高NO3组间差异不显著（P＞0.05）。

瘤胃微生物已适应硝酸盐时，对照组与中、低NO3组的干物质消化率均差异显著（P＜0.05），与高NO3组差异极显著（P＜0.01）。瘤胃微生物未适应硝酸盐时的低NO3组与已适应硝酸盐时的低NO3组、中NO3组差异不显著（P＞0.05），与高NO3组间差异显著（P＜0.05）。瘤胃微生物未适应硝酸盐的中NO3组与已适应硝酸盐的低NO3组、中NO3组差异显著（P＜0.05），与高NO3组差异极显著（P＜0.01）。瘤胃微生物已适应硝酸盐的高NO3组与低NO3组、中NO3组差异显著（P＜0.05），瘤胃微生物适应硝酸盐前后的高NO3组间干物质消化率差异极显著（P＜0.01）。

3 讨论

本研究结果表明，对照组的干物质消化率显著低于瘤胃微生物已适应硝酸盐时的低、中、高NO3组（P＜0.05）。瘤胃微生物已适应硝酸盐时，低、中、高NO3组间的干物质消化率差异不显著（P＞0.05）。出现这种现象的原因是瘤胃微生物已适应硝酸盐，亚硝酸盐转化成氨的速度与硝酸盐的还原成亚硝酸盐的速度持平甚至超过，使瘤胃微生物可以利用更多的氮，并且适应后瘤胃微生物利用硝酸盐的能力大幅加强[10]。而微生物未适应硝酸盐时，低NO3组的干物质消化率显著高于对照组、中NO3组和高NO3组（P＜0.05）。出现这种状况的原因是少量的硝酸盐进入瘤胃会经瘤胃微生物的作用还原成亚硝酸盐，并进一步还原成氨，为瘤胃微生物提供氮源，促进其对干物质的消化[9]。

更大剂量的硝酸盐进入瘤胃时，硝酸盐还原成亚硝酸盐的速度会逐渐加快，甚至超过亚硝酸盐还原成氨的速度，在此过程中产生的亚硝酸盐则表现出毒性作用，引起干物质消化率降低[10]。试验结果证明，可通过逐渐添加硝酸盐的方法使反刍动物逐步适应硝酸盐，且不影响干物质消化率。

4 结论

试验结果表明，硝酸盐在瘤胃微生物消化干物质的过程中起着重要的作用，能够促进干物质的消化吸收。

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