亚甲基四氢叶酸还原酶和胱硫醚-β-合成酶基因多态与唐氏综合征发生的关系

廖亚平 张 鼎 周 伟 刘长青 董淮富

(蚌埠医学院细胞生物学教研室，安徽 蚌埠 233030)

亚甲基四氢叶酸还原酶和胱硫醚-β-合成酶基因多态与唐氏综合征发生的关系

廖亚平 张 鼎 周 伟 刘长青 董淮富1

(蚌埠医学院细胞生物学教研室，安徽 蚌埠 233030)

目的 探讨母体5，10-亚甲基四氢叶酸还原酶(MTHFR)基因和胱硫醚-β-合成酶(CβS)基因多态性与唐氏综合征(DS)发生的关系。方法 应用聚合酶链反应-限制性片段长度多态性(PCR-RFLP)方法检测70例DS患儿母亲和117例对照女性的MTHFR 两个多态位点(C677T、A1298C)，利用SHEsis在线分析软件进行单体型和连锁不平衡分析；PCR法检测CβS 844Ins68基因型。Pearson χ2 检验各基因和基因型频率分布的差异。计算比值比评价相对危险度。结果 MTHFR基因两个多态位点及CβS 844Ins68突变基因频率和基因型频率在病例组和对照组中分布无显著差异(P>0.05)。MTHFR 677T/T / 1298(C/C+C/A)联合基因型显著地增加DS发生风险(OR=8.46，95%CI：0.90～79.51，P<0.05)。MTHFR 两个多态位点存在连锁不平衡(D′=0.68)；677T-1298C单体型与DS发生显著相关(OR=5.22，95%CI：1.37～19.94，P<0.01)。结论 MTHFR两个位点变异联合分析及677T-1298C单体型可能是DS发生的风险因素，不能排除叶酸代谢酶基因多态在DS发生中的作用。

唐氏综合征；5，10-亚甲基四氢叶酸还原酶；胱硫醚-β-合成酶；基因多态性

唐氏综合征(DS)又称21三体综合征，主要表现为智力低下和发育迟缓，该征病因明确，但诱发因素和发病机制仍不清楚。女性高龄生产是该病较为明确的风险因素，但超过80%的DS患儿母亲年龄<35岁。近年一些研究显示母体叶酸缺乏及叶酸代谢相关基因多态可能与DS的发生相关〔1，2〕。5，10-亚甲基四氢叶酸还原酶(MTHFR)是叶酸代谢的关键酶，其基因编码区存在2个常见单核苷酸多态(C677T、A1298C)。这两个位点的变异可影响叶酸代谢和DNA甲基化。目前，叶酸代谢相关基因多态与DS发生的关系国内外报道不一〔1，3～7〕。MTHFR基因单体型及胱硫醚-β-合成酶(CβS)基因844位插入一个68 bp的多态性片段(844Ins68)与DS发生的关系国内未见报道。本研究以安徽蚌埠地区汉族人群为研究对象，探讨母源MTHFR基因C677T和A1298C位点及CβS 844Ins68多态与DS发生的关系。

1 材料与方法

1.1 研究对象 收集安徽蚌埠地区曾生育DS患儿的母亲血样70份，年龄19～45岁，汉族，相互间没有血缘关系，染色体核型分析正常。正常对照血样117份，与病例母亲生活环境相同，年龄在22～45岁，未曾生育DS患儿且没有不良妊娠史，无糖尿病、冠心病和高血压等病史。

1.2 试剂与方法

1.2.1 DNA提取，目的片段PCR扩增 无菌采集外周静脉血4 ml，EDTA抗凝，-20℃保存。柱式全血基因组DNA抽提试剂盒提取DNA。基因组DNA抽提试剂盒购自上海生工生物工程有限公司，PCR扩增试剂盒购自MBI Fermentas试剂公司。操作按说明书进行。PCR扩增引物：MTHFR A1298C正义引物：5′-CTTTGGGGAGCTGGACTACTAC-3′，正义引物：5′-CACTTTGTGACCATTCCGGTTTG-3′；MTHFR C677T正义引物：5′-TGAAGGAGAAGGTGTCTGCGGGA-3′，正义引物：5′-AGGACGGTGCGGTGAGAGTG-3′；CβS 844Ins68正义引物：5′-CTGGCCTTGAGCCCTGAA-3′，正义引物：5′-GGCCGGGCTCTGGACTC-3′。

引物由上海Sangon公司合成。PCR扩增体系含10倍缓冲液2.5 μl，dNTPs 2.5 μl(2 mmol/L)，MgCl22 μl(终浓度1.5 mmol/L)，正、反义游引物各0.5 μl(10 pmol/μl)，Taq酶0.5 μl(2 U /μl)，DNA 1 μl(约100 mg)，总体积25 μl。PCR反应条件94℃预变性5 min，94℃变性30 s，MTHFR A1298C、C677T和CβS 844Ins68分别退火60 s、63 s和59 s，延伸30 s，共35个循环。扩增产物用2%琼脂糖凝胶电泳检测。

1.2.2 PCR-RFLP分析 限制性核酸内切酶Hinf Ⅰ 、MboⅡ购自MBI Fermentas试剂公司。将PCR产物纯化后酶切，酶切反应体系30 μl，包括PCR扩增产物10 μl，限制性核酸内切酶10 U，缓冲液2 μl，ddH2O 17 μl。反应体系在37℃水浴锅中温浴10 h，经3%琼脂糖凝胶(含EB)电泳分析，紫外凝胶成像仪下观察带型并摄像，根据带型判读基因型，随机选取各基因型测序验证。

1.3 统计学分析 计算基因型频率和等位基因频率，Hardy-Weinberg平衡检验确认研究样本的群体代表性。采用Pearsonχ2检验比较病例组与对照组基因型、基因频率和各基因联合基因型分布，必要时采用Fisher精确概率检验。计算比值比(ORs)评价相对危险度。单体型(haplotype)和连锁不平衡分析采用SHEsis软件采用SPSS17.0软件。

2 结 果

2.1 MTHFR C677T、A1298C和CβS 844Ins68多态位点检测 MTHFR C677T目的片段扩增产物198 bp，Hinf I酶切后纯合突变型T/T为175、23 bp，杂合基因型C/T为198、175、23bp，野生基因型C/C为198bp(图1)。MTHFR A1298C目的片段扩增产物163 bp，MboⅡ酶切后产生56、31、30、28、18 bp片段为A/A基因型，84、56、31、30、28、18 bp为A/C基因型，84、31、30、28 bp为C/C基因型(图2)。CβS目的片段扩增242 bp为844 Ins68纯合子，出现242、174 bp两个片段为杂合子，只有174 bp片段为未插入基因型纯合子(图3)。

1：C/C基因型；2，3～5：C/T基因型；4：T/T基因型

1，3，4，6，7：A/A基因型；2：A/C基因型；5：C/C基因型；M：Low MW DNA 标准

M：100 bp DNA标准；1～3，5～7：Ins-/Ins-基因型；4：Ins+/Ins-基因型

2.2 MTHFR C677T、A1298C和CβS 844Ins68等位基因和基因型频率的分布 经Hardy-Weinberg平衡检验病例组和对照组各基因型达到遗传平衡(P>0.05)，具有群体代表性。病例组 MTHFR 677T 和1298C 等位基因频率均高于对照组，但未达统计显著性水平(P>0.05)。CβS 844Ins68等位基因频率在两组中分别为0.7%和0.4%，经χ2检验差异无显著性(表1)。MTHFR C677T、A1298C和CβS 844Ins68 各基因型频率在两组间分布差异无统计学意义(表1)。见图1～图3。两组均未检出CβS 844Ins68 突变纯合子，在中国人群中该插入频率较低。

2.3 联合基因型分析与单体型分析 分析存在的联合基因型分布，评价潜在的基因与基因之间及相同基因不同多态位点的相互作用。MTHFR 677(T/T)/ 1298(C/C+A/C)联合基因型显著地增加DS发生风险(OR=8.46，95%CI：0.90～79.51，P<0.05)(表2)。单体型分析显示，MTHFR C677T、A1298C 存在较紧密连锁不平衡(D′=0.68)，该调查人群中存在MTHFR 677T-1298C 单体型，该单体型与DS发生风险相关(OR=5.22，95%CI：1.37～19.94，P<0.01)(表3)。其他相关基因型的交互作用与DS发生风险的关系无统计学意义。

表1 MTHFR A1298C、C677T和CβS 844Ins68基因型、等位基因频率及分布〔n(%)〕

表2 两组MTHFR两个位点联合基因型的相互作用〔n(%)〕

表3 两组MTHFR C677T 和 A1298C单体型分析(%)

3 讨 论

女性年龄的增大可能导致其体内纺锤体组装检验点等保障染色体精确分离的功能被“磨损”削弱而最终导致染色体分离异常，然而多数DS患儿母亲较年轻，提示可能存在其他的易感因素〔2，8，9〕。叶酸缺乏及代谢障碍可影响DNA甲基化，使DNA链不稳定，引起DNA链断裂、染色体重排和不分离〔9〕。叶酸代谢相关基因变异可能导致叶酸代谢障碍和叶酸功能性缺乏有关。

MTHFR基因存在2个常见多态位点，MTHFR C677T多态性可产生不耐热的突变体而导致酶活性下降，进而引起血浆同型半胱氨酸(Hcy)水平上升，叶酸及一碳单位代谢障碍〔1〕。MTHFR基因的另一个常见突变位点为A1298C并产生了一个MboⅡ酶切位点，对应编码的谷氨酸被丙氨酸替代。该位点同样可以影响酶的活性，特别是与C677T多态位点合并分析时。James等〔1〕提出：MTHFR酶活性降低，可影响叶酸和一碳单位代谢，导致DNA低甲基化，是DS发生的风险因素。而相关研究显示MTHFR C677T和A1298C多态性与DS发生的关系尚存在争议〔10〕。本研究发现，MTHFR A1298C位点变异在安徽皖北人群中频率较C677T多态频率低，和国内相关研究相符〔4，11〕；本文病例组 C677T 和A1298C 变异基因频率和基因型频率均高于对照组，但未达统计显著性水平，但MTHFR 677(T/T)/ 1298(C/C+ A/C)联合基因型与DS发生显著相关，与王文等〔4〕研究相符。

本文显示无论在病例组还是对照组，T-A单体型呈现强连锁，而T-C频率较低，说明人群中存在对T-C单体型的负性选择〔12，13〕。来自巴西、意大利等地的多项研究肯定了该基因2个位点的相互作用并认为是DS发生的风险因素〔14，15〕，该结果也在本研究中得到证实。最近，Wu等〔16〕Meta分析亦支持MTHFR多态与DS的发生相关。

CβS是Hcy代谢的一种关键酶，催化Hcy转变为胱硫醚。基因变异可引起酶活性改变从而影响血浆Hcy水平。CβS基因第8外显子第844 位存在68 bp 片段的插入(844ins68)，该插入导致了酶蛋白质空间构象的改变，进而降低了酶活性。目前认为该插入突变与先天性心脏病、神经管缺陷和唇腭裂有关。21三体胎儿含有3份CβS基因，导致体内Hcy水平下降形成所谓的“甲基叶酸陷阱”和功能性叶酸缺乏可能导致胚胎的难以存活〔17〕。母体CβS 基因变异导致血浆总Hcy水平增高可能是维持21三体胎儿存活而免于流产的一个原因。本研究未发现CβS 844ins68多态与DS的发生相关，与Scala等〔14〕和Fintelman-Rodrigues等〔18〕研究相符。本组资料显示CβS 844ins68发生频率相当低，未发现纯合插入突变，与美国、意大利和巴西人群存在差异，和国内报道的相符〔14，18～20〕。

综上所述，虽然叶酸代谢与DS发生关系尚存一定争议，本研究结果表明不能排除中国人群叶酸代谢相关基因特别是MTHFR基因突变在DS发生中的作用。进一步研究应获取叶酸代谢异常、甲基化障碍而导致卵母细胞21号染色体不分离的直接实验证据，以解释流行病学的研究结果。

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〔2013-09-17修回〕

(编辑 赵慧玲/曹梦园)

安徽省自然科学基金青年基金项目(1208085QC67)；蚌埠医学院自然科学研究项目(BY1019)

廖亚平(1977-)，男，副教授，硕士，主要从事非整倍体疾病研究。

R394

A

1005-9202(2015)12-3370-04；

10.3969/j.issn.1005-9202.2015.12.086

1 蚌埠医学院第一附属医院儿科