高乌甲素对人非小细胞肺癌A549细胞株的作用及机制

郑富霞

(河南省中医院肺病科，河南 郑州 450000)

高乌甲素对人非小细胞肺癌A549细胞株的作用及机制

郑富霞

(河南省中医院肺病科，河南 郑州 450000)

目的 观察高乌甲素(LA)对人非小细胞肺癌(NSCLC)A549细胞株的作用并探讨其可能存在的分子机制。方法 采用由中山大学医学院实验动物中心细胞库提供的人NSCLC细胞株A549株。通过给予不同浓度的LA进行干预和MTT比色分析法、实时荧光定量PCR以及流式细胞仪等检测方法，探讨不同浓度的LA对NSCLCA549细胞株的生长抑制、凋亡率、细胞周期和Cyclin E1表达的影响。结果 LA对细胞的抑制作用规律呈剂量依赖性，相较于对照组，浓度在0.48～7.68 mg/ml的LA对于细胞的抑制作用均有着统计学差异(P<0.05)；在相应的各时间点，浓度为0.48和0.96 mg/ml的LA组A549细胞凋亡率均有着统计学的差异(P<0.05)；浓度为0.96 mg/ml的LA组细胞周期G0/G1期比例显著上升，而S期比例下降(P<0.05)；浓度为0.48和0.96 mg/ml的LA组A549 细胞的Cyclin E1 mRNA相对表达量均明显低于对照组(P<0.05)。结论 LA具有抗肿瘤的疗效，其分子机制可能与肿瘤细胞的生长、凋亡、细胞周期以及Cyclin E1表达有关。

高乌甲素；非小细胞肺癌

非小细胞肺癌(NSCLC)占已诊断肺癌的85%左右，其中大部分患者在确诊的时候病情已进入了晚期，无法通过手术而治愈。对于放、化疗，晚期肺癌的敏感性欠佳，同时由于存在放化疗毒性反应，从而对其疗效的提高进行了限制，故找寻低毒高效的天然药物对治疗NSCLC特别是晚期患者有着重要的价值〔1〕。本研究旨在通过对高乌甲素(LA)对人NSCLC A549细胞株作用的观察，探讨其可能存在的分子机制。

1 资料与方法

1.1 实验材料 采用由中山大学医学院实验动物中心细胞库提供的人NSCLC细胞株A549株。于RPMI-1640培养液(含链霉素和青霉素各10 U/ml，10%的胎牛血清)中进行常规培养，连续培养于5% CO2、37℃饱和湿度的培养箱内，采用0.25%的胰蛋白酶对其进行消化传代。主要试剂和药品：中国科学院华南植物所制备的盐酸LA；美国Sigma公司生产的RNA酶、碘化丙啶(PI)和二甲基亚砜(DMSO)、链霉素、青霉素和胰蛋白酶。美国Gibco公司生产的RPMI-1640培养液。杭州四季青生物工程材料有限公司生产的胎牛血清。南京凯基生物技术有限公司生产的Annexin V-FIFC/PI试剂盒；Fermentas公司生产的Maxima® SYBR Green/ROX qPCR Master Mix(2×)和RevertAidTMFirst Strand cDNA Synthesis Kit；上海英骏生物技术有限公司生产的PCR引物。实验主要仪器：美国ABI公司生产的ABI Stepone Plus荧光实时定量PCR仪；美国Sigma公司生产的冷冻高速离心机；美国BD公司生产的BD FACSAAria流式细胞仪；日本Olympus株式会社生产的IX51倒置荧光显微镜；芬兰TECAN GeNios公司生产的MK3型酶标仪；新加坡Esco公司生产的超净工作台；德国Memmert公司生产的电热恒温干燥器；波兰Shel-Lab公司生产的CO2培养箱。

1.2 细胞增殖抑制率的测定 采用MTT比色分析法。选择对数生长期A549细胞(细胞数1×103/孔)，注入96孔培养板内过夜培养，第2天加入LA，最终的浓度分别是0.06、0.12、0.24、0.48、0.96、1.92、3.84、7.68 mg/ml，在阴性对照组中只加PBS，一种浓度设置5个复孔。于5% CO2、37℃饱和湿度的培养箱内进行48 h的培养。将20 μl的MTT液注入每孔进行培养，4 h后去除上清液，以150 μl/孔加入DMSO液，使用酶标仪选取492 nm波长对各孔的光密度D(λ)进行测定，细胞增殖抑制率(%)=〔1- D(λ)实验组/ D(λ)阴性对照〕×100%，对药物所起的抑制作用进行观察，计算IC50。

1.3 A549细胞凋亡率的检测 采用Annexin V-FIFC/PI双标法。选取对数生长期A549细胞，于6孔板内接种，24 h培养后，将浓度分别为0.24、0.48、0.96 mg/ml的LA加入其中培养，24、36、48 h后，在离心管内转入5×105细胞，提取50 μl与缓冲液结合，重悬细胞，将Annexin V-FIFC及PI分别注入其中，避光室温下10 min上样，即可用流式细胞仪测定细胞凋亡。重复3次该实验。

1.4 A549细胞周期的检测 选择对数生长期A549细胞，于6孔板内接种，24 h培养后，将浓度分别为0.24、0.48、0.96 mg/ml的LA加入其中培养。48 h后用PBS液洗涤，将细胞收集，在4℃ 75%的酒精溶液内封口，于-20℃下固定12 h。离心、洗涤，在RNase的溶液内重悬，避光条件下静置半小时，将PI溶液加入其中，避光孵育半小时，用300目筛网滤过后，用流式细胞仪对细胞周期进行检测，一次分析细胞10 000个，Cell Quest软件分析数据，用各期细胞所占比值形式表示。重复3次该实验。

1.5 CyclinE1基因表达的检测 实时荧光定量PCR。选择对数生长期A549细胞，于6孔板内接种，24 h培养后，将浓度分别为0.24、0.48、0.96 mg/ml的LA加入其中培养。48 h后，去除上清液，Trizol法对各组细胞的总RNA进行提取，各自取1 μg进行反转录，获取cDNA作模板，对Cyclin E1 mRNA的转录水平实施实时荧光定量PCR法进行检测，内参照物为β-actin。引物序列：β-actin，扩增产物152 bp，上游：5'- TGACCGGTATATGGCGACAC-3'，下游：5'- CTCCTGAACAAGCTCCATCTG-3'；扩增产物109 bp，上游：5'- ACAGAGCCTCGCCTTTGCCGAT，下游：5'- CTTGCACATGCCGGAGCCGTT-3'；Invitrogen公司合成。扩增条件：95℃10 min；95℃15 s、60℃30 s、72 ℃15 s，总共循环40个。数据用比较CT法分析，目的基因相对表达量用2-△△CT表示，将对照组目的基因mRNA均数表示为1，对各处理组的CyclinE1 mRNA相对表达量进行计算。该实验重复3次。

1.6 统计学方法 采用SPSS19.0软件进行t检验和χ2检验。

2 结 果

2.1 LA对A549细胞生长的抑制作用 LA对细胞的抑制作用规律呈剂量依赖性，相较于对照组〔(0.1±0.8)%〕，浓度在0.48、0.96、1.92、3.84、7.68 mg/ml的LA对于细胞的抑制作用〔(13.2±4.4)%、(22.4±5.7)%、(41.3±6.8)%、(59.2±8.4)%、(82.2±9.1)%〕均有着统计学差异(P<0.05)。0.06、0.12、0.24 mg/ml LA对细胞抑制率〔(1.5±0.8)%、(3.0±1.3)%、(7.1±3.3)%〕与对照组无明显差异。将LA浓度与其对细胞的抑制率行直线回归分析，方程为:Y = 6.94+10.895X，计算得48 h 高乌甲素的IC50为3.952 mg/ml。

2.2 LA对A549细胞凋亡的作用 相较于对照组，在相应的各时间点，浓度为0.48和0.96 mg/ml的LA组A549细胞凋亡率均有着统计学的差异(P<0.05)。见表1。

2.3 LA对A549细胞周期的影响 相对于对照组，浓度为0.96 mg/ml的LA组的细胞周期G0/G1期比例显著上升，而S期比例下降(P<0.05)。见表2。

2.4 LA对Cyclin E1的表达影响 0.48和0.96 mg/ml LA组A549 细胞Cyclin E1 mRNA相对表达量(0.802±0.161、0.774±0.147)均明显低于对照组(1±0)(P<0.05)。0.24 mg/ml LA组表达量(0.921±0.214)与对照组差异不明显。

表1 LA对A549细胞凋亡率的影响

与对照组相比较：1)P<0.05，下表同

表2 LA对A549细胞周期的影响

3 讨 论

肿瘤干细胞、肿瘤多药耐药机制以及化疗带来的毒副作用都限制了肺癌治疗期间化疗的应用。针对晚期肺癌患者，中医药有着其独特的优点，可以延长生存期、改善患者的生活质量、缓解症状以及提高患者自身的机体免疫力〔2〕。对于放、化疗，中医药有着逆转化疗耐药、诱导凋亡和分化等的减毒和增效的作用。通常晚期肺癌患者由于癌痛的折磨而严重影响了其自身的生存质量，故化疗药经常用镇痛药来止痛。中医学上认为，肿瘤疼痛的根本原因是经络气血失调，表现为气滞血瘀、痰湿阻滞以及经络闭阻等。趋势化痰、通络以及活血化瘀等是其主要的治疗方法，临床上长期应用可以获取较好的疗效。LA作为非成瘾性的镇痛药，属于中药单体，有着较好的镇痛效果。前期的实验〔3〕结果显示，LA与铂类药物结合使用有着增敏的作用。最近的研究结果显示，LA有着潜在的抗肿瘤的作用。对人急性白血病细胞株HL-60，LA注射液有着潜在诱导凋亡和分化的作用〔4〕。

本实验说明LA存在抗肿瘤的作用。最近的研究〔5〕显示，天然产物能通过细胞周期阻滞或诱导凋亡对肿瘤的生长进行抑制。CyclinE调控细胞从G1期进入至S期限制点R，如果通过此限制点，细胞则无法逆转，只能进入细胞周期，其作为G1/ G0期的一个重要调节者，于大量的肿瘤细胞内呈高表达的状态。细胞周期从G0期进入G1期，需要积累一定量的CyclinE1。Rb磷酸化以及G0期至G1期的转换末期能使CyclinE1活化。其表达与大量肿瘤预后、进展、侵袭、转移、形成均密切相关。大量的化疗药可以通过激活细胞周期的检测点，达到抑制损伤修复和肿瘤周期阻滞的目的，从而对肿瘤的分裂、增殖进行抑制。对CyclinE1表达的抑制，可以起到控制细胞周期的增殖期间的细胞数(乃至肿瘤增殖)的重要作用〔6〕。本实验的结果发现，LA可以抑制A549的细胞生长，致使G1/ G0期阻滞以及肿瘤细胞凋亡。LA存在下调CyclinE1表达的可能，但尚需深入研究其具体的体内外分子作用机制〔7〕。

1 Yang HJ,Youn H,Seong KM,etal.Phosphorylation of ribosomal protein S3 and antiapoptotic TRAF2 protein mediates radioresistance in non-small cell lung cancer cells〔J〕.J Biol Chem,2013;288(5):2965-75.

2 Li Y,Chao Y,Fang Y,etal.MTA1 promotes the invasion and migration of non-small cell lung cancer cells by downregulating miR-125b〔J〕.J Exp Clin Cancer Res,2013;32(1):33-40.

3 Zhou M,Li Y,Liu C,etal.Simultaneous determination of lappaconitine hydrobromide and isopropiram fumarate in rabbit plasma by capillary electrophoresis with electrochemiluminescence detection〔J〕.Electrophoresis,2012；33(16):2577-83.

4 Tan C,Qian X,Jia R,etal.Matrine induction of reactive oxygen species activates p38 leading to caspase-dependent cell apoptosis in non-small cell lung cancer cells〔J〕.Oncol Rep,2013;30(5):2529-35.

5 Yoon HJ,Cho YR,Joo JH,etal.Knockdown of integrin alpha3 beta1 expression induces proliferation and migration of non-small cell lung cancer cells〔J〕.Oncol Rep,2013;29(2):662-8.

6 Miao L,Zhu S,Wang Y,etal.Discoidin domain receptor 1 is associated with poor prognosis of non-small cell lung cancer and promotes cell invasion via epithelial-to-mesenchymal transition〔J〕.Med Oncol,2013;30(3):626-35.

7 Ju L,Zhou C.Association of integrin beta1 and c-MET in mediating EGFR TKI gefitinib resistance in non-small cell lung cancer〔J〕.Cancer Cell Int,2013;13(1):15-23.

〔2013-12-15修回〕

(编辑 苑云杰)

2008年度河南省医学科技攻关项目(200803048)；2007年度河南省卫生厅普通攻关项目(200703021)

郑富霞(1974-)，女，医师，硕士，主要从事呼吸系统疑难疾病研究。

R734

A

1005-9202(2015)12-3231-02；

10.3969/j.issn.1005-9202.2015.12.019