蛛网膜下腔出血大鼠基底动脉及血浆eNOS、ICAM-1、TN-C和PGF2α的表达变化

吴 雷 郭 华 高子云 胡尚伟 沈晓黎 祝新根

(南昌大学第二附属医院神经外科，江西 南昌 330006)

蛛网膜下腔出血大鼠基底动脉及血浆eNOS、ICAM-1、TN-C和PGF2α的表达变化

吴 雷 郭 华 高子云 胡尚伟 沈晓黎 祝新根

(南昌大学第二附属医院神经外科，江西 南昌 330006)

目的 探讨eNOS、ICAM-1、TN-C和PGF2α在蛛网膜下腔出血(SAH)后不同时间点基底动脉、血浆表达情况及其与脑血管痉挛的关系。方法 SD大鼠 42只，随机分成:对照组(n=6)、假注血组(n=18)、SAH 组(n=18)。假注血组及SAH 组进一步按时间随机分为术后1、7、11 d 3个亚组，每组 6 只。采用枕大池二次注血法建立大鼠 SAH 模型。二次注血后在各个时间点采集实验动物血液标本,处死动物,取脑组织及基底动脉，测定基底动脉横截面积判断有无脑血管痉挛;应用RT-PCR分别观察eNOS、ICAM-1、TN-C和PGF2α在基底动脉中的表达情况;应用ELISA检测eNOS、ICAM-1、TN-C和PGF2α在血浆中的表达情况;原位细胞凋亡检测法检测颞叶神经元凋亡情况。结果 枕大池二次注血法成功制作 SAH 模型，基底动脉发生了不同程度的血管痉挛。SAH组与对照组和假注血组相比大鼠基底动脉横截面积明显减少。RT-PCR及ELISA观察到ICAM-1、TN-C和PGF2α在SAH组高表达。而eNOS在SAH组中低表达,第7天表达水平最低。eNOS浓度降低，皮质神经元凋亡指数升高，ICAM-1、TN-C和PGF2α浓度升高，皮质神经元凋亡指数升高。结论 SAH 后eNOS,ICAM-1,TN-C,PGF2α表达水平的变化与脑血管痉挛发展的时相性具有一定的一致性，eNOS,ICAM-1,TN-C,PGF2α可能参与SAH后脑血管痉挛的发生。

蛛网膜下腔出血;eNOS;ICAM-1;TN-C;PGF2α;RT-PCR;脑血管痉挛

脑血管痉挛(CVS)是蛛网膜下腔出血(SAH)最严重的并发症之一，是引起高致残率、致死率的重要原因。SAH后CVS的病因和机制仍不清楚。有研究显示CVS与血管内及周围一氧化氮(NO)含量下降有关，外源性NO难以应用于CVS，有效的NO供体成为研究热点。本研究观察内皮型一氧化氮合酶(eNOS)、细胞间黏附分子(ICAM)-1、肌糖蛋白 C(TN-C)、前列腺素(PGF)F2α等因子在SAH后CVS发生时的表达变化。

1 材料与方法

1.1 动物与试剂 雄性SD大鼠42只，体重290～350 g，由南昌大学动物实验中心提供，自由进食，昼夜节律喂养。主要实验试剂Trizol-A、cDNA 合成试剂盒、逆转录聚合酶链反应试剂盒、ELISA试剂盒。对照组6只：不作任何处理；假注血组18只：48 h内两次枕大池穿刺注入生理盐水0.3 ml；SAH组18只：48 h内两次枕大池穿刺注入自体动脉血0.3 ml。假注血组及SAH组分为1 d、7 d、11 d 3个亚组，每组 6只。

1.2 模型制作 取SD大鼠麻醉后，后颈部及右侧股动脉区备皮、消毒后；大鼠仰卧位，钝性分离右侧股动脉抽取股动脉血0.3 ml留以备用，改俯卧位后钝性分离枕部肌肉暴露枕骨，用1 ml针管穿刺入枕大池，在2 min内将0.3 ml动脉血注入枕大池，缝合伤口。48 h后同法取左侧股动脉血0.3 ml注入枕大池，制成大鼠SAH动物模型。假注血组2次注入枕大池为生理盐水。

1.3 标本采集及测定 不同时间点抽取动物血液标本放入含100 g/L依地酸二钠60 μl试管中混匀,采用酶联免疫吸附试验(ELISA)测定血清eNOS、ICAM-1、TN-C和PGF2α，严格按试剂盒说明书操作。分别于建模后第1、7、11天处死大鼠，剥离其脑组织对颞叶皮质切片进行染色，按试剂盒操作，观察颞叶皮质切片中神经元凋亡情况：所有受试动物进行颞叶皮质神经元凋亡监测，凋亡指数为颞叶皮质切片1 000个神经元中的TUNEL染色阳性细胞。剥离其基底动脉组织部分行石蜡包埋后行HE染色检查，光镜下观察并测量基底动脉血管内径，横截面积(面积采用显微镜计算机图像分析系统测量基底动脉横截面积)，血管舒张度(D/T值：指动脉血管内径与管壁厚度之间的比值)。另一部分冻存于-80℃冰箱中，统一行eNOS、ICAM-1、TN-C和PGF2α检测，将eNOS、ICAM-1、TN-C、PGF2α和管家基因(β-actin)进行实时荧光定量 PCR。反应条件:95℃变性2 min，40个循环94℃变性20 s,58℃(eNOS)、61℃(ICAM-1)、56℃(TN-C)、55℃(PGF2α)退火20 s,72℃延伸30 s,74℃读板。扩增产物经脂糖凝胶电泳后，用内参照β-actin光密度值标化eNOS、ICAM-1、TN-C和PGF2α mRNA的吸光度值，得到eNOS、ICAM-1、TN-C和PGF2α mRNA表达的相对含量。eNOS、ICAM-1、TN-C和PGF-2α及β-actin序列如下:eNOS正义引物:5'-CCGGCTGCCACCTGATCCTA-3',反义引物:5'-AACATGTGTCCTTGCTCGAGG CA-3'。ICAM-1正义引物:5'- AGACACAAGCAAGAGAAGAA-3',反义引物:5'- GAGAAGCCCAAACCCGTATG-3'。TN-C正义引物:5'-TCCTGCTGACTGTCACAATC-3',反义引物:5'-TGCTCACATACACATTTGCC-3'。PGF2α正义引物:5'-ACTGGCATGCTCCCCAGCGGA-3',反义引物:5'-GTGCCGTTAGTCTCTGAGGCG-3'。β-actin正义引物:5'-TACAACCTCCTTGCAGCTCC-3',反义引物:5'-GGATC TTCATGAGGTAGTCATTC-3'。

1.4 统计学分析 采用SPSS13.0统计软件包进行t检验、χ2检验及Spearman等级相关分析法。

2 结 果

2.1 基底动脉标本观察 对照组和假注血组脑干腹侧基底动脉周围无血凝块，基底动脉内皮结构完整血管管腔较大，内膜平滑肌呈扁平状，无卷曲；SAH组见基底动脉周围可见明显的凝血块，但随着时间的推移，周围凝血块大小和范围逐渐减少，基底动脉内皮结构排列紊乱，内径减小，内膜平滑肌细胞排列紊乱，卷曲皱折，厚薄不均，细胞外间质增多，7 d达到最明显改变，11 d上述改变明显减轻。见图1。

图1 各组大鼠基底动脉组织学形态(HE，×100)

2.2 各组基底动脉横截面积及管壁比较 基底动脉行 HE 染色后，对照组和假注血组基底动脉无明显痉挛：SAH组第1、7和11天基底动脉横截面积、血管内径和D/T值均明显低于对照组和假注血组(P<0.05)。对照组和假注血组基底动脉横截面积、血管内径和D/T值差异不明显，无统计学意义(P>0.05)。见表1。

表1 各组大鼠基底动脉横截面积、血管内径和D/T值

与对照组比较：1)P<0.05;与同时段假注血组比较：2)P<0.05

2.3 颞叶皮质神经元凋亡指数比较 对照组和假注血组第1、7和11天大鼠颞叶皮质神经元结构紧凑，数目正常，排列整齐；对照组颞叶神经元凋亡指数为(1.7±1.0)%，假注血组1、7、11 d颞叶神经元凋亡指数为(1.8±1.0)%、(2.0±1.1)%、(2.1±0.9)%。SAH组大鼠颞叶皮质神经元结构松散，数目减少，排列紊乱，颞叶神经元凋亡指数SAH组1 d明显升高〔(17.6±2.4)%〕，7 d颞叶神经元凋亡指数升高最明显〔(32.0±4.4)%〕，SAH组11 d后指数逐渐降低〔(28.7±4.0)%〕(P<0.05)。

2.4 血清eNOS、ICAM-1、TN-C和PGF2α浓度 SAH组各eNOS表达水平明显低于对照组及同时间点假注血组，以7 d降低最明显(P<0.05)。SAH组ICAM-1、TN-C表达水平明显高于对照组及同时间点假注血组(P<0.05)。SAH组PGF2α表达在1 d及7 d组水平明显高于对照组及同时间点假注血组(P<0.05)，且随时间逐渐降低，7 d和11 d表达水平明显低于1 d。见表2。

2.5 各组大鼠基底动脉eNOS、ICAM-1、TN-C和PGF2α mRNA表达情况 SAH组大鼠基底动脉eNOS表达明显低于对照组和同期假注血组，ICAM-1、TN-C、PGF2α表达明显高于对照组和同期假注血组(P<0.05)。见表3。

2.6 eNOS、ICAM-1、TN-C和PGF2α在SAH大鼠血清中表达与神经元凋亡指数的相关性分析 大鼠SAH组7 d eNOS、ICAM-1、TN-C和PGF2α各血清值变化最为明显，通过颞叶神经元凋亡指数与eNOS、ICAM-1、TN-C和PGF2α表达相关分析结果显示，eNOS表达与颞叶神经元凋亡指数呈负相关(r=-0.586,P=0.01)，ICAM-1、TN-C与PGF2α表达与颞叶神经元凋亡指数呈正相关(r=0.652,P=0.02;r=0.696,P=0.03;r=0.784,P=0.02,P<0.05)。

表2 各组大鼠血清eNOS、ICAM-1、TN-C和PGF2α表达水平

与对照组比较：1)P<0.05;与同期假注血组比较：2)P<0.05;与SAH组1 d比较：3)P<0.05，下表同

表3 各组大鼠基底动脉eNOS、ICAM-1、TN-C和PGF2α mRNA表达水平

3 讨 论

CVS是SAH的常见并发症，也是最严重的并发症之一,其发病率为30%～90%，轻者可引起脑供血不足，严重可发生迟发性缺血障碍(DID)，导致脑梗死甚至死亡，是SAH后致残和死亡的主要原因〔1,2〕。NO是由L-精氨酸与分子氧在NOS 的催化下生成的，作为一种可以通过生物膜扩散的气体自由基，其可调节调节心血管系统、神经系统和免疫功能，且能快速弥散进入平滑肌细胞从而引起血管松弛,是维持脑血管张力的重要因子之一。eNOS作为NOS的异构体，主要存在于内皮细胞和神经细胞，可持续低量地合成、释放NO，使血管处于舒张状态〔3,4〕，是预测SAH后CVS的有用指标之一〔5〕。张珑等〔6〕通过血管内基因转染的方法，来了解eNOS防治SAH后迟发性CVS的疗效，结果发现，在对以内皮功能失常和内皮依赖性舒血管作用降低为特点的OVS中，eNOS可作为一种特异性治疗，可能对于SAH后迟发性CVS具有一定的疗效。ICAM-1高表达可促进单核细胞和淋巴细胞与内皮细胞黏附,使氧自由基、蛋白溶酶、白三烯、血小板活化因子等与内皮细胞反应，直接损伤内皮或导致内皮功能障碍，从而引起炎症反应〔7～10〕。TN-C是一种大分子量的细胞外基质的糖蛋白，在胚胎发育、炎性反应以及伤口愈合的过程中可一过性的表达，其特征与纤维连接蛋白和层黏连蛋白有许多相似之处〔11〕。PGF2α〔12,13〕是通过参与其他自体活性物质、神经递质和激素的调解而发挥作用的。在生理状态下，主要作用于血管和平滑肌，参与血小板凝集、炎症反应、神经冲动传导和细胞生长等。PGF2α在细胞水平的具体作用机制因细胞种类不同，发挥的作用也不同。

本研究通过以二次注血法将自体动脉血直接注入蛛网膜下腔造模，造模后可见基底动脉内皮结构排列紊乱，卷曲皱折，厚薄不均，内膜下及外膜可见炎性细胞浸润，血管管径变细，周围可见明显的凝血块，但随着时间的推移，周围凝血块大小和范围逐渐减少，提示SAH后CVS造模成功〔14,15〕。各组基底动脉横截面积及管壁比较发现，对照组和假注血组基底动脉横截面积、血管内径和D/T值差异不明显，而SAH组明显低于对照组和假注血组。SAH组大鼠颞叶皮质神经元结构松散，数目减少，排列紊乱，凋亡数量明显高于对照组及假注血组,进一步证实了SAH后CVS造模成功。

本实验表明eNOS表达下调，可能与SAH后血管内皮细胞的功能存在一定的关系，参与了SAH后CVS的发展，SAH后ICAM-1、TN-C、PGF2α影响血管内皮功能的稳定性，由此可引发的一系列病理反应，导致SAH后CVS的形成。eNOS表达与颞叶神经元凋亡指数呈负相关，ICAM-1、TN-C与PGF表达与颞叶神经元凋亡指数呈正相关。本实验结果提示，eNOS表达可能对SAH后的神经损伤具有保护作用；而ICAM-1、TN-C与PGF2α的高表达可诱发脑细胞的凋亡,人为改变SAH后eNOS、 ICAM-1、TN-C与PGF2α的表达可能阻断SAH后的病理过程。

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〔2013-12-07修回〕

(编辑 赵慧玲/曹梦园)

江西省科技厅科技支撑项目(20111BBG70022-4)

郭 华(1972-)，男，主任医师，主要从事干细胞及脑血管病的研究。

吴 雷(1980-)，男，博士，主治医师，主要从事干细胞及脑血管病的研究。

R74

A

1005-9202(2015)12-3206-04；

10.3969/j.issn.1005-9202.2015.12.009