血吸虫病抗体检测试纸条对实验感染水牛的抗体检测

阳爱国，周 煜，郭 莉，董国栋，毛光琼，邓永强，田慧云，吴云飞， 侯 巍，马 坤，陈 冬，文 豪，朱银宝

（1.四川省动物疫病预防控制中心，四川成都610041；2.湖北省动物疫病预防控制中心，湖北武汉430000；3.云南省动物疫病预防控制中心，云南昆明650051；4.四川省广汉市动物疫病预防控制中心，四川广汉618003；5.南京路宝生物科技有限公司，江苏南京210000）

血吸虫病是由裂体吸虫属血吸虫引起的一种慢性人畜共患寄生虫病，主要流行于亚、非、拉美的78个国家和地区［1］，而我国的血吸虫病主要由日本血吸虫引起［2］。日本血吸虫严重威胁着我国疫区人们的健康和生命安全，也给畜牧业造成巨大的经济损失［3］。耕牛是血吸虫的重要宿主，血吸虫尾蚴通过感染耕牛，在牛体内发育成熟产出虫卵，耕牛排出大量粪便的同时也将虫卵排出到水田、水渠等野外污染水环境，人们通过动物使役或田间作业时感染血吸虫病原［4－5］。因此，耕牛血吸虫感染率高低在一定程度上决定了当地血吸虫病的流行程度。而使用适当的血清学方法普查血吸虫病水牛，筛选出治疗目标群体是低成本控制血吸虫病疫情的重要手段［6］。

以往，通常采用IHA、Dot－ELISA［7］或胶体金［8］等血清学技术对耕牛开展普查工作，但这些方法不同程度存在操作复杂、效率低、需要一定实验条件以及稳定性低等缺点，用于基层普查筛选工作限制较多［9－13］。而本试验使用的牛血吸虫抗体检测试纸条是利用乳胶微球免疫层析法（DLIA）原理研制的血清免疫学诊断方法，它是近年从胶体金免疫层析法（GICA）基础上发展起来的新技术［14］。与胶体金相比，乳胶微球是高分子微球，颗粒大（200nm～300 nm）［15］，用红色乳胶微球代替胶体金作为标记物可以用更少的抗体或抗原在几分钟内就能清晰显色，判断结果；乳胶微球的羧基与兔抗牛IgG 的氨基共价结合，形成乳胶微球－兔抗牛IgG 结合物，稳定性好，大小均一，制备的试纸条质量更可控。血吸虫在畜体内存在尾蚴、童虫、成虫、虫卵四个不同阶段，各阶段的虫体及其分泌物均可作为抗原刺激机体产生抗体，然而从刺激到产生抗体需要一定时间；如果动物体内的抗原消失，抗体也需要一定时间才能消失［16］。因此，本试验采用牛血吸虫抗体检测试纸条检测实验感染血吸虫水牛治疗前后不同时间的抗体水平，明确可检出的时间极限，为试纸条是否具有早期诊断价值和疗效参考价值提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 试验用动物及血吸虫尾蚴 10头健康耕牛来自血吸虫病非疫区，均为水牛，年龄2岁，体重约500kg，经粪孵及Dot－ELISA 确诊为血吸虫阴性。试验水牛随机编号为1 号～10 号。血吸虫尾蚴为从疫区采集的阳性钉螺放逸。

1.1.2 检测试剂及药品 牛血吸虫病抗体检测试纸条，南京路宝生物科技有限公司产品（批号：20130525）；兽用吡喹酮，南京制药厂产品（批号：20130121）。

1.2 方法

1.2.1 牛实验感染血吸虫 用接种环挑取血吸虫尾蚴至于载玻片上，在40倍显微镜下观察计数。对水牛的背部剃毛，将已计数的有尾蚴的盖玻片贴于水牛裸露皮肤处感染5min～10min，每头水牛接种1 000条尾蚴。

1.2.2 血纸的制备

1.2.2.1 水牛感染血吸虫前后血纸的制备 在实验室感染血吸虫尾蚴前，按照常规方法制备血纸［17］，作为0周的血纸样品。水牛感染后第1周～第7周，每头水牛每周制备一次血纸，4℃保存备用。

1.2.2.2 水牛感染血吸虫治疗后血纸的制备 水牛感染血吸虫第7周后用吡喹酮进行治疗，治疗后每隔4周制备一次血纸，直至24周，4℃保存备用。

1.2.3 实验感染牛血吸虫的治疗 10头水牛实验感染血吸虫后第7周，使用吡喹酮的治疗感染耕牛，使用剂量按0.06g／kg进行，隔7d后再治疗一次。

1.2.4 实验感染血吸虫水牛治疗前后血纸抗体的检测

1.2.4.1 操作前准备 试纸条从冰箱取出置室温平衡1h。

1.2.4.2 操作步骤 将各血纸进行编号，裁剪血纸圆片0.24cm2放在0.4mL 血纸浸泡液中，室温浸泡30min；取试纸条，将带箭头端的试纸条插入已摇匀浸泡好的血纸液中，待液体在NC 膜上渗出0.5 cm 左右时，将试纸条平放在盘中或桌面上，5min～30min内观察结果。

1.2.4.3 结果判定 T、C线均出现红色带，判为阳性；仅C 线出现红色带，则判为阴性；T、C 线均不出现红色带，判为无效。

2 结果

2.1 实验感染血吸虫水牛临床症状的变化

感染血吸虫尾蚴的水牛在感染后第4周～5周时开始出现明显的精神沉郁、采食量下降、被毛凌乱、拉稀、消瘦等血吸虫病症状。经过药物治疗后展现良好疗效，感染牛精神状态好转，采食量提高，拉稀停止。

2.2 感染水牛治疗前后不同时间血吸虫抗体的检出情况

试纸条测定10头人工接种血吸虫水牛治疗前后的血纸抗体消长规律结果显示，接种前的10头水牛血纸均为阴性；水牛在接种血吸虫毛蚴的第4周检测到6头水牛血吸虫抗体呈阳性，即1号、2号、4号、6号、7号和9号水牛，随后抗体一直递增，感染水牛第5周10头水牛抗体全部呈阳性。使用吡喹酮药物治疗后，感染水牛血吸虫抗体在治疗后第16周逐步转为阴性，1号、3号和8号水牛在此时抗体消失；2号、5号、6号和10号水牛在治疗后的第20周抗体消失；4号、7号和9号水牛在治疗后的第24周抗体消失，至此10头水牛血吸虫抗体均为阴性，从图表可以看出该试纸条具有早期诊断和疗效考核价值（表1）。

表1 人工感染血吸虫水牛治疗前后抗体检测结果Table 1 The results of anti－schistosome antibody detection in blood paper of experimentally infected buffalo before and after treatment

3 讨论

接种血吸虫尾蚴抗原数量多少直接关系到水牛能否成功感染血吸虫病原，也关系到水牛产生血吸虫抗体及治疗后抗体消失的时间长短。卢福庄等［18］研究表明，在接种血吸虫尾蚴200 条／头～1 100条／头的范围内，血吸虫抗体可达到的最高水平，治疗后抗体转阴时间与接种尾蚴的数量之间似乎没有一定的规律，故本试验选择1 000条血吸虫尾蚴进行接种能很好的诱导机体产生抗体。从检测结果来看，接种后第4周血吸虫抗体阳性数为6头，阳性率为60%，直到第5周抗体阳性率才为100%；治疗后第16周，血吸虫抗体阴性有3头，阴性率为30%，直到第24 周时才全部转阴。虽然都接种1 000条血吸虫尾蚴，但10头感染的水牛并没有在第4周同时产生阳性反应，治疗后10头水牛也没有在第16周抗体同时转为阴性，感染后抗体的产生和治疗后抗体的消失10头水牛需要的时间并不一致。这是由于虽然相同数量的抗原刺激动物机体，但由于不同水牛之间的免疫系统发育水平各有差异，导致抗原刺激机体后产生免疫应答的时间和强度不同，从而使抗体产生和消失的时间有所差异。

目前，国内外尚无用乳胶微球免疫渗滤法检测血纸抗体的试纸条来研究家畜血吸虫抗体消长水平的相关研究。张雪娟等［19］用Dot－ELISA 方法研究牛实验感染血吸虫前后及治疗后抗体的动态变化曲线，该方法可在感染后1周～2 周检测出血吸虫抗体，并在治疗后31周～42周抗体消失。李友等［20］以血吸虫重组融合蛋白（rLHD－Sj23－GST）间接ELISA 法检测牛感染血吸虫的血清抗体，结果表明，在感染后5周～8周（多数在7周～8 周）抗体呈阳性，感染后18周～34周转阴。赵清兰等［21］用重组LHD－Sj23蛋白乳胶凝集试验（检测IgM）检测实验感染血吸虫牛血清，感染后第3周可以检测出抗体，治疗后第13周抗体开始转阴，但没有明确最迟转阴的时间是多少。卢福庄等［18］利用金标免疫渗滤法研究牛、兔实验室感染血吸虫治疗前后抗体的消长规律，结果表明，金标免疫渗滤法可在牛感染后2周～4周内检测出血吸虫抗体，治疗后27周～39周抗体消失。因此，推测本试纸条的敏感性优于rLHD－Sj23－GST 间接ELISA 法和LHD－Sj23蛋白乳胶凝集试验，低于Dot－ELISA 法和金标免疫渗滤法。本试验成功反映了人工接种血吸虫尾蚴水牛抗体水平的消长规律，指示牛血吸虫血纸抗体检测试纸条在血吸虫抗体检测的临床意义，用该试纸条判断水牛是否感染了血吸虫病最好在间隔5周的时间连续检测2次；用于治疗药物的疗效考核应在患血吸虫病水牛治疗6个月后进行较为妥当。

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