套管针技术在肝原位移植瘤模型的应用

李凌云 张斌豪 张必翔



·论 著·(实验研究)

套管针技术在肝原位移植瘤模型的应用

李凌云 张斌豪 张必翔

目的 研究套管针技术在肝原位种植瘤中的作用，及其安全性和有效性。方法 裸鼠皮下接种HCCLM3细胞，成瘤后将皮下瘤组织分别用套管针技术和传统肝包膜切开法进行肝癌组织原位移植。统计两种方法的手术时间、出血量、术后并发症发生率。利用HE染色检测肝原位移植瘤。结果 两种方法肝原位移植瘤的成瘤率均为100%，应用套管针技术组手术时间为(15.60±0.84) min明显低于包膜切开组的(21.40±2.37) min(P<0.001)，且术中出血量(6.06±2.05) mg明显低于包膜切开组的(25.25±7.07) mg(P<0.001)。传统包膜切开组术后肠粘连等并发症高于套管针技术组。结论 套管针技术可以安全、有效地应用于肝原位移植瘤模型，提高手术效率，减少术中出血量和术后并发症的发生率，使肝脏原位移植瘤更符合实验要求。

套管针；肝癌；原位种植；动物模型

肝脏由于其特殊的组织结构，在肿瘤原位种植中存在很多特殊的困难。首先其质地脆弱且血流丰富，传统的肝内组织种植容易出血并且将种植组织冲出肝脏；其次肝实质内血窦丰富，细胞种植不易固定，很容易沿肝窦及血管扩散从而使原位种植失败。基质胶的应用从一定程度上解决了肝内细胞种植的问题，但是这一产品还存在很多缺陷，如注射时间不易把握、种植过程中的细胞扩散尚未彻底解决、价格昂贵等。相反，肝内组织种植由于组织的固定形态不容易发生种植过程中细胞扩散。因此，只要解决了种植过程中的出血问题，肝内组织种植较细胞种植具有更大的优势。我们采用套管针技术进行肝癌组织原位种植，与传统的肝包膜切开法进行比较，研究其可行性、安全性和有效性。

材料与方法

一、材料

1.细胞、动物与试剂 人肝癌细胞系HCCLM3由本实验室保存。细胞用含5mmol/L谷氨酰胺的DMEM高糖培养基(Hyclone公司)加10%胎牛血清(Gibico公司)培养，置于37℃含5%CO2培养箱中培养。雄性4～6周龄Balb/c裸小鼠由同济医院实验动物中心订购，无特殊病原体环境下饲养。

2.皮下成瘤试验 消化贴壁细胞成单细胞悬液并计数，将5×106肝癌细胞悬浮在200 μl生理盐水中，吹打混匀后接种到裸鼠肩胛皮下。共接种4处皮下瘤备用。2周后皮下瘤直径约1 cm，消毒皮肤去除皮下瘤，修剪肿瘤周围纤维结缔组织。取肿瘤外围鲜嫩组织，用刀片切成直径约1 mm的小块组织置于冰上生理盐水中用于肝脏原位移植。肿瘤离体至移植时间不超过3 h。

3.肿瘤组织移植专用套管针的制作 选择内径约1 mm的针头和合适规格的套管针内芯组合做成组织移植专用套管针。要求套管针针芯完全插入针腔后，前端稍超出针尖。将明胶海绵撕成小块后自针尖逆向填塞针腔约5 mm，近针尖部位预留约2 mm空间待填塞组织用。用同样方法将预先准备好的肿瘤组织块放入预留针腔内后，插入套管针针芯待用。

4.建立肝内原位移植瘤模型 肝内原位肿瘤移植分为两组，即套管针推注组(n=10)和传统的肝脏包膜切开组(n=10)。裸鼠用乙醚吸入麻醉，选择上腹正中切口约8 mm，暴露肝脏左外叶。选择肝左外叶远端为肿瘤种植部位。套管针推注组直接将填塞号明胶海绵和肿瘤组织的套管针刺入肝实质约5 mm，然后推动针芯至有较大阻力感时停止推注。右手固定针芯，左手扶住针头并沿针芯方向退出针头。肿瘤组织与明胶海绵被完整植入肝实质，小棉球压迫止血(图1)。包膜切开组用眼科剪刺破肝包膜至肝实质约深3 mm，将组织块直接塞入窦道中，小棉球压迫止血后用明胶海绵覆盖包膜破口。止血并确定植入组织块未脱出后将肝脏复位，关腹。

二、检测指标与检测方法

1.手术时间与术中出血量评估 术中分别记录两组所用手术时间。为评估手术出血量，术前准备无菌小棉球，称重保证每个小棉球重量为5 mg。术中用小棉球止血或清理残血，在完成每只动物肝内移植术后称量所用棉球的总重量。称量所得的术中所用棉球总重量减去棉球使用前的预计重量(棉球数×5 mg)即代表术中出血量。

图1 套管针技术肝内原位种植过程

2.解剖学与组织学观察 肝内种植2周后B超每周观察肿瘤大小一次，B超测定以肿瘤直径大于0.5 cm为成癌标准，并绘制生长曲线。种植后6周末处死裸鼠，仔细观察肿瘤大小、形态以及周围淋巴结、各内脏有无肿瘤转移;腹水的量与性状；肠粘连梗阻等并发症。

3.HE染色鉴定肝内移植瘤 10%甲醛固定肝内移植瘤，石蜡包埋切片，进行HE染色以确定移植瘤形成。

三、统计学分析

结 果

一、两种种植方法术中比较

套管针技术组术中出血量为(6.06±2.05) mg，明显低于包膜切开组的(25.25±7.07) mg，P<0.001，差异有统计学意义。套管针技术组手术时间为(15.60±0.84) min，明显低于包膜切开组的(21.40±2.37) min，P<0.001，差异有统计学意义(表1)。

二、肝脏原位瘤成瘤情况

两种方法肝原位移植瘤的成瘤率均为100%。术后2周初诊动物腹部均可触及肝内单发结节，同时超声检查辅助诊断均证实肝内成瘤。两组动物肝内种植瘤成长状况无显著差异(图2)。

三、大体解剖与组织学检测

种植后6周末处死裸鼠，解剖腹部各脏器，我们发现动物左外叶肝脏均已成瘤。两组动物肝内移植瘤大小无明显差异。通过HE染色证实肝内移植瘤形成(图3)。

表1 两组术中情况及术后成瘤比较

图2 肝内移植瘤生长曲线

图3 肝内移植瘤及正常肝(HE染色，×100)

四、术后并发症比较

套管针组肿瘤均位于肝内，未发生腹腔内转移、肠粘连等并发症。传统包膜切开组术后肠粘连等并发症明显高于套管针技术组。其中4只(40%)发生肿瘤与大网膜或肠壁粘连，5只(50%)发生左外叶肝与中叶粘连，肿瘤侵犯腹壁发生切口转移和腹腔种植转移各1只(10%)。

讨 论

肿瘤原位种植是肿瘤生物学研究，尤其是肿瘤器官特异性转移相关研究中常用的方法[1-2]，包括肿瘤细胞种植和组织种植。在欧美发达国家，由于肝癌发病率低，在肝癌方面的研究较少。其研究主要集中在乳腺癌、结直肠癌、肺癌、前列腺癌等方面[3-4]。在乳腺癌[5-6]，结肠癌[7-8]等方面的研究，其原位肿瘤动物模型的制作多采用细胞注射或传统的组织种植。而在皮下、乳腺、胃肠道等结缔组织丰富的组织或器官，运用以上方法并无多大困难。

我国肝癌发病率高，是影响国民健康的重大疾病[9-10]，为探讨肝癌的发病机制需开展大量的研究工作。肝癌研究同其他肿瘤有着相同的研究模式，但肝脏由于其特殊的组织结构，在肿瘤原位种植中存在很多困难，如肝内组织种植容易出血而将种植组织冲出肝脏、细胞种植不易固定等。影像医学有关于超声介导下进行肝内细胞悬液注射[11-13]，但这种方法较开腹肝内注射更难避免肿瘤细胞逆流而导致腹腔种植转移。肝内组织种植由于组织的固定形态不容易发生种植过程中细胞扩散，可以在肝内形成单发肿瘤以模拟肝癌的发生发展过程。因此只要解决了出血问题，这一技术具有更广阔的应用前景。目前，肝内组织种植仍沿用传统的被膜切开技术[14-17], 少有文献报道快捷可行的新方法。

我们在动物模型制作过程中探索性应用套管针技术，发现这一技术可以将肝癌组织更准确地种植到理想的部位，并利用针腔中的明胶海绵填充进针形成的窦道而起到充分止血的目的(图4)。这一技术可以缩短手术时间，减少肝脏出血和肠梗阻等种植并发症。同时，本技术更能按照实验需要在肝脏特定部位形成单发肿瘤，提高肝脏移植瘤的有效性。我们发现包膜切开组小鼠因术中失血较多，术后体温明显降低且麻醉恢复时间延长。因此，套管针技术较包膜切开法更为安全，可以降低动物死亡率。

图4 套管针技术肝内原位种植原理

另外，应用套管针技术进行组织种植可以扩展到肝脏以外的组织或器官。虽然其他一些组织或器官用传统的组织移植方法不存在太大困难，但由于套管针技术具有安全快捷和微创等特点，同样可以在这些组织器官应用。例如，皮下组织种植需要切开缝合皮肤[18]，而套管针技术只需要像使用注射器那么简单；胃肠壁肿瘤组织种植需要缝合部分肠壁[19]，发生肠梗阻概率较高，而套管针技术不会引起肠腔狭窄。因此，本技术在其他组织器官肿瘤组织种植中的应用有待进一步研究。

1 Chen HJ,Sun J,Huang Z,et al.Comprehensive models of human primary and metastatic colorectal tumors in immunodeficient and immunocompetent mice by chemokine targeting.Nat Biotechnol, 2015,33:p.656-660.

2 Yano S,Hiroshima Y,Maawy A,et al.Color-coding cancer and stromal cells with genetic reporters in a patient-derived orthotopic xenograft (PDOX) model of pancreatic cancer enhances fluorescence-guided surgery.Cancer Gene Ther,2015.doi: 10.1038/cgt.2015.26.

3 Siegel RL, Miller KD, Jemal A.et al.Cancer statistics, 2015.CA Cancer J Clin,2015,65:5-29.

4 Torre LA,Bray F,Siegel RL,et al.Global cancer statistics, 2012. CA Cancer J Clin,2015,65:87-108.

5 Bos PD,Zhang XH,Nadal C,et al.Genes that mediate breast cancer metastasis to the brain.Nature,2009,459:1005-1009.

6 Kim MY,Oskarsson T,Acharyya S,et al.Tumor self-seeding by circulating cancer cells.Cell,2009,139:1315-1326.

7 Zhang B,Halder SK,Kashikar ND,et al.Anti-metastatic role of Smad4 signaling in colorectal cancer.Gastroenterology,2010, 138:969-980.

8 Metildi CA,Kaushal S,Luiken GA,et al.Fluorescently labeled chimeric anti-CEA antibody improves detection and resection of human colon cancer in a patient-derived orthotopic xenograft (PDOX) nude mouse model.J Surg Oncol,2014,109:451-458.

9 Zhu P,Lau WY,Chen YF,et al.Randomized clinical trial comparing infrahepatic inferior vena cava clamping with low central venous pressure in complex liver resections involving the Pringle manoeuvre.Br J Surg,2012,99:781-788.

10Chen XP,Qiu FZ,Wu ZD,et al.Chinese experience with hepatectomy for huge hepatocellular carcinoma.Br J Surg,2004,91:322-326.

11张火俊,陈栋,田建明，等. B超引导下大鼠种植性肝癌模型的建立.中国医-学计算机成像杂志,2005,11:122-124.

12丁磊,陈孝平,张志伟,等.B超引导下建立裸鼠原位肝细胞癌多药耐药模型.中华实验外科杂志,2006,23:1555.

13程文,张青萍,贡雪灏,等.超声引导下穿刺种植制作大鼠肝癌模型的方法学探讨.放射学实践,2004,19:174-175.

14Tian J,Tang ZY,Ye SL,et al, New human hepatocellular carcinoma (HCC) cell line with highly metastatic potential (MHCC97) and its expressions of the factors associated with metastasis.Br J Cancer,1999,81:814-821.

15李雁,汤钊猷,等.体内连续筛选法建立自发性肺转移人肝癌细胞系.中华医学杂志,2002,82:p.601-605.

16Yao J,Liang L,Huang S,et al.MicroRNA-30d promotes tumor invasion and metastasis by targeting galphai2 in hepatocellular carcinoma.Hepatology,2010,51:846-856.

17Sawada S,Murakami K,Yamaura T,et al.Intrahepatic metastasis by orthotopic implantation of a fragment of murine hepatocellular carcinoma and its related molecules.Tumor Biol,2001,22:154-161.

18Yonou H,Yokose T,Kamijo T,et al.Establishment of a novel species-and tissue-specific metastasis model of human prostate cancer in humanized non-obese diabetic/severe combined immunodeficient mice engrafted with human adult lung and bone.Cancer Res,2001,61:2177-2182

19闫明霞,姚明,刘乾,等.裸小鼠人胃癌肝转移模型的筛选和建立.实验动物与比较医学,2005,25:2-76.

Role of trochar technique on estabilishing the orthotopic intrahepatic tumor xenografting model

LiLingyun*,ZhangBinhao,ZhangBixiang.

*DivisionofGeneralSurgery,No. 3People’sHospital,Jingzhou434001,China

,ZhangBinhao,Email:bhzhang8@163.com

Objective To investigate the role of trochar in the estabilishment of orthotopic intrahepatic tumor xenografting model. Methods The subcutaneous tumors were generated by inoculating HCCLM3 cells subcutaneously to the athymic mice. The mall pieces of the subcutaneous tomors were transplanted to the left lateral hepatic lobes with trochar technique or conventional discission of the hepatic capsule. The operative time, intrahepatic blood losss and postoperative complications were assessed. HE staining was used to judge if the intrahepatic tumor formed. Results All of the mice formed intrahepatic tumors after transplantation of the tumor tissues either by the trochar technique or discission of the hepatic capsule. The mean surgical duration of the trochar group was 15.06 min, significantly shorter than the discission group (21.4 min). The intrahepatic blood loss and the incidence of postoperative complications such as intestinal obstruction in the trochar group were also significantly reduced when compared with the discission group. Conclusions These results provide evidence that trochar technique can be appplied to establish the orthotopic intrahepatic tumor xenograftiong mocdel efficiently and securely. The present investigation also indicates that the trochar technique is better than the conventional discission of the hepatic capsule when being applied to intrahepatic tumor transplantation.

Trochar; Liver cancer; Orthotopic xenografting; Animal model

434001 湖北荆州,荆州市第三人民医院普通外科(李凌云);华中科技大学同济医学院附属同济医院肝脏外科中心(李凌云、张斌豪、张必翔)

张斌豪，Email：bhzhang8@163.com

R735.7

A

10.3969/j.issn.1003-5591.2015.06.022

2015-06-02)