柳叶亚菊中酚类化合物的抗氧化和抗肿瘤活性及凋亡机制*

张 伟， 巫洪儒， 梁乾坤， 李云霞， 卢研宇， 龙 瑶， 祝 英， 李红芳,3△

(1. 兰州大学基础医学院生理学教研室， 2. 甘肃省新药临床前研究重点实验室， 3. 兰州大学基础医学院机能实验室，4. 兰州大学应用有机化学国家重点实验室， 甘肃兰州730000)



柳叶亚菊中酚类化合物的抗氧化和抗肿瘤活性及凋亡机制*

张 伟1,2， 巫洪儒4， 梁乾坤1， 李云霞1， 卢研宇2， 龙 瑶2， 祝 英4， 李红芳1,2,3△

(1. 兰州大学基础医学院生理学教研室， 2. 甘肃省新药临床前研究重点实验室， 3. 兰州大学基础医学院机能实验室，4. 兰州大学应用有机化学国家重点实验室， 甘肃兰州730000)

目的：从柳叶亚菊植物中提取的两种具有显著生物活性的天然苯酚类化合物4-羟基-3,5-二甲氧基-4-(2-丙酮基)环己烷-2,5-二烯-1-酮和6-甲氧基-5,7-二羟基香豆素(分别命名为Ⅰ号和Ⅱ号)，分析测定其抗氧化活性和抗肿瘤活性及其促凋亡机制。方法：采用DPPH和ABTS自由基法以及MTT法分别测定两种化合物抗氧化和体外抗肿瘤活性，利用RT-PCR测定两种化合物对人血癌细胞株K562细胞核转录因子NF-κB P65 mRNA的表达以及Western blot测定其对核转录因子NF-κB P65、Fas、β-catenin和E-cadherin四种蛋白表达的影响。结果：①抗氧化实验分析得出Ⅰ号化合物具有强烈的抗氧化活性而Ⅱ号化合物无抗氧化活性；②抗肿瘤(MTT)实验分析数据可知Ⅰ号化合物无抗肿瘤活性而Ⅱ号化合物具有强烈的抗肿瘤活性；③利用实时定量q-PCR测得加入Ⅱ号化合物组与空白组相比，NF-κB P65 mRNA的表达明显上调(P<0.05)；④通过Western blot实验得出Ⅱ号化合物组核转录因子NF-κB P65、Fas、β-catenin和E-cadherin四种蛋白的表达明显上调(P<0.05)，并且蛋白表达量与药物浓度呈现明显剂量效应关系。结论：两种酚类化合物分别具有抗氧化和抗肿瘤活性，Ⅱ号化合物的抑癌作用机理可能一方面通过上调NF-κB P65、Fas表达，进入经典的Fas凋亡信号通路；另一方面，通过诱导β-catenin连环蛋白以及E-cadherin钙粘蛋白的表达上调，二者参与细胞间的粘连，对防止癌细胞的扩散和肿瘤的转移具有重大意义。

酚类化合物；抗氧化活性；抗肿瘤活性；核转录因子-κB P65；Fas受体；β-连环蛋白；E-钙粘蛋白

亚菊属植物柳叶亚菊，主要分布在我国北部和西南部地区，具有清热解毒、消炎止血等作用；柳叶亚菊植物所含化学成分复杂，主要有苯酚类、倍半萜类、三萜甾体类、苯丙素类黄酮类等。此外，还含有生物碱、多糖及一些脂肪酸等。苯酚类化合物是从柳叶亚菊植物中分离得到种类最多的化学成分之一，也是其最主要的有效成分。近年来，随着分子生物学、细胞生物学、遗传学等的发展，人们对中医药防治血癌作用机制的研究已上升到了基因、细胞信号转导等微观水平。虽然许多研究已经证实从柳叶亚菊中提取的酚类物质具有抗氧化抗肿瘤活性，但是凋亡机制尚未明确[1]。核转录因子-κB是一种多效可诱导的核转录因子，能调节多种基因的表达和细胞因子的产生，广泛存在于真核细胞中，近来研究证实从柳叶亚菊中提取的酚类化合物能诱导核转录因子-κB P65的表达。本实验应用q-PCR、免疫组化和Western blot等方法观察酚类化合物对核转录因子-κB P65和细胞凋亡的影响，进一步揭示酚类化合物诱导细胞凋亡的分子机制，从而为临床治疗提供确切的理论基础[2]。

1 材料和方法

1.1 材料

从柳叶亚菊中提取的酚类化合物4-羟基-3,5-二甲氧基-4-(2-丙酮基)环己烷-2,5-二烯-1-酮和6-甲氧基-5,7-二羟基香豆素(Ⅰ和Ⅱ,兰州大学天然有机国家重点实验室提取)；人血癌细胞株K562细胞购置中科院上海细胞所；MTT、顺铂(ACROS ORCANICS)、5-Fluorouracil ≥99%购自Sigma公司；RPMI-1640培养基Thermo scientific产品；胎牛血清(HyClone)、胰蛋白酶(Hyclone)购自Thermo公司；DPPH，ABTS，BHA和Trolox购自Sigma-Aldrich公司；PCR引物由Intitrogen公司合成；Trizol RNA抽提试剂购置life公司；逆转录试剂盒购置于Promega公司；q-PCR试剂盒是Bestar Sybr Gree qPCR mastermix产品；NF-κB P65(A)、ZS-109兔抗人单克隆抗体和Fas抗体购置于北京中杉金桥；E-cadherin抗体、β-catenin和β-actin抗体购自于Santa Cruz Biotechnology公司。

1.2 两种化合物对ABTS和DPPH两种自由基抗氧化测定

待测样品Ⅰ号和Ⅱ号的抗氧化活性通过清除2 ,2-联氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二铵盐(2,2'-Azinobis-(3-ethylbenzthiazoline-6-sulphonate, ABTS+)和1，1-二苯基-2-三硝基苯肼 (1,1-Diphenyl-2-picrylhydrazyl radical 2,2-Diphenyl-1-(2,4,6-trinitrophenyl)hydrazyl, DPPH)自由基来测定，两类化合物各100 μl的甲醇溶液分别与100 μl的ABTS+和DPPH溶液混合加入到96孔板；室温避光环境下反应0.5 h；然后分别在酶标仪734 nm(ABTS+)和517 nm(DPPH)波长下测定OD值;配制同一样品的5个不同浓度2.5～40 μg/ml；单纯ABTS+和DPPH孔代表空白组；水溶性维生素E(6-hydroxy-2,5,7,8-tetramethylchroman-2-carboxylic acid,Trolox)和丁基羟基茴香醚(Butyl hydroxyanisd,BHA)作为阳性对照，甲醇的纯溶液作为调零组[1]；设定5个浓度梯度3个复孔；捕捉效率的计算公式抑制率(%)=[A0-(At-B)]/A0×100% (t=6 min)。A0代表不加药物的空白组；At代表加入梯度药物与自由基反应时间为6 min(ABTS+)和10 min(DPPH)；B代表甲醇纯溶液的调零组；IC50表示药物清除自由基一半时所需的药物浓度[1]。

1.3 MTT法测定两种化合物的抗肿瘤活性

因为两种化合物是脂溶性的，所以必须用二甲基亚枫(dimethyl sulfoxide, DMSO)助溶；工作液中加入的DMSO的浓度应该小于终浓度的1%，K562细胞浓度为9×104cells/ml加入到96孔板里面，每个孔90 μl然后加入药物10 μl；药物设定5个浓度梯度5～80 μg/ml；孵育48 h，加入10 μl MTT(浓度5 mg/ml PBS溶解)继续培养4 h，最后加入三联液100 μl(10% SDS 和0.01 mol/L HCl) 37℃过夜，用酶标仪测定570 nm波长OD值； IC50表示药物促凋亡一半时所需的药物浓度。计算抑制率公式抑制率(%)=(未加药的A570-加药的A570)/未加药的A570[3]。

1.4 实时定量PCR测定NF-κB P65 mRNA表达

Trizol试剂常规提取总RNA，经核酸紫外分析仪检测，根据A260/A280的比值确定了RNA样品的纯度(A260/280=1.9～2.0)和含量;提取的RNA的浓度最好是1 μg/μl；取1 μl每组细胞提取的RNA按照Promega试剂盒说明合成出cDNA；再取1 μl逆转录产物进行PCR[4]，按照PCR试剂盒说明书一般扩增30～35个循环；β-actin做为内参基因引物序列：上游5’-TCCCTGGAGAAGAGCTACGA-3’,下游5’-AGCACTGTGTTGGCGTACAG-3’,目的基因NF-κB P65引物序列上游5’-GGGGACTACGACCTGAATG-3’,下游5’-CGGGCACGATTGTCAAAGAT-3’,mRNA含量的计算：通过实时定量PCR计算出的Ct值，利用2-ΔΔCt法算出各组mRNA的相对含量。

1.5 免疫印迹法测定药物干预后目的蛋白的表达

1.5.1 实验分组及蛋白提取培养人血癌细胞株 K562细胞，设定一个不加药的空白对照组和化合物Ⅰ号和Ⅱ号各三个浓度梯度组(5、10、20 μg/ml)；培养24 h后，提取蛋白；每瓶细胞加入RIPA裂解液300 μl裂解10 min，冰浴两次(每次5 min)结束后漩涡混匀30 s，4℃离心(12 000×g，10 min)，上清移至新的EP管中，蛋白提取完毕；冻存与-70℃冰箱备用[4]。

1.5.2 配胶和电泳 (1)配置10%分离胶和5%的浓缩胶：取要上样的蛋白样品30 μg/well；提取的蛋白按照5∶1的比例加入蛋白上样缓冲液煮沸变性5 min，取出后立即放置于冰上(防止蛋白复性)，然后用SDS-PAGE垂直凝胶电泳分离不同分子量蛋白质，浓缩胶10 mA 20 min，分离胶15 mA 60 min，当溴酚蓝条带至凝胶底部时，停止电泳。

1.5.3 转膜 用半干法转移至PVDF膜进行免疫印迹，其中I抗为β-actin、NF-κB P65、FAS、E-cadherin和β-catenin兔抗人单克隆抗体，稀释浓度为1∶1 000，II抗为辣根过氧化物酶(HRP)山羊抗兔IgG，稀释浓度为1∶10 000；增强化学发光法，X片放射自显影，扫描，最后用凝胶图像分析软件Gelpro32测定灰度值。

1.6 统计学分析

2 结果

2.1 Ⅰ号Ⅱ号化合物对DPPH和ABTS自由基的清除活性

Trolox作为ABTS自由基的阳性对照而BHA作为DPPH自由基的阳性对照，Ⅰ号化合物和Ⅱ号化合物作为实验组，ABTS和DPPH作为两种药物的作用底物；加药后48 h的作用结果可知：Ⅰ号化合物对DPPH的IC50值为1.99 μg/ml，对ABTS自由基的IC50值为1.49 μg/ml和Ⅱ号化合物对ABTS和DPPH两种自由基的IC50值>40 μg/ml差异有显著性(P<0.01，表1)。与空白对照组相比，加入浓度梯度的Ⅰ号化合物后，OD值显著减小并呈现明显的剂量效应关系(P<0.05)，加入Ⅱ号化合物的实验组与空白组之间OD值无明显变化(图1)。

2.2 Ⅰ号Ⅱ号化合物的抗肿瘤活性

阳性对照组Cisplatin(IC50)为9.318 μg/ml；Fluorouracil (IC50) 为13.125 μg/ml；与对照组相比加入Ⅰ号化合物后细胞无凋亡现象,OD值无明显差异，IC50值>80 μg/ml；与对照组相比Ⅱ号化合物的IC50值12.174 μg/ml，细胞出现显著凋亡(P<0.05，图2)。

GroupDPPHABTSTrolox(IC50)ND4.8±0.557BHA(IC50)6.83±0.408NDⅠ(IC50)1.99±0.222**##1.49±0.168**##Ⅱ(IC50)NANA

BHA： Butyl hydroxyanisd； Trolox： 6-hydroxy-2,5,7,8-tetramethylchroman-2-carboxylic acid； Trolox and BHA as positive control groups； NA: No inhibitory activity at >40 μg/ml; ND: Not determined; IC50: A half of maximal inhibitoryconcentration

**P<0.01vstrolox group；##P<0.01vsBHA group

Fig. 1 Relationship of dose reaction bettween efficiency of radical-scavenging and phenol consentrations A: Capacity that Trolox and compound Ⅰ clear away ABTS free radical; B: Capacity that BHA and compound Ⅰ clear away DPPH free radical; ABTS: 2,2-Gzinobis-(3-ethylbenzthiazoline-6-sulphonate)

Fig. 2 Cisplatin and fluorouracil as positive control groups*P<0.05vscisplatin group;#P<0.05vsfluorouracil group

2.3 Ⅱ号化合物对K562细胞NF-κB P65 mRNA表达的影响

通过实时定量PCR测出的各组的Ct值通过Ct值采用2-ΔΔCt法算出mRNA的相对含量。空白对照组mRNA的表达量设定为1，三个药物浓度组mRNA的表达量为空白组的倍数。与对照组相比加入Ⅱ号化合物的三个药物浓度组mRNA的表达量随着加入药物浓度的增加而而呈现梯度增加(P<0.05，P<0.01，图3)。

2.4 Ⅱ号化合物对四种蛋白表达的影响

NF-κB P65和FAS受体蛋白的表达量随着药物浓度的升高逐渐升高，呈现明显的剂量效应关系。β连环蛋白(β-catenin)和E-粘连蛋白(E -cadherin)二者共同参与细胞间的粘附；通过实验结果可知二者表达量随药物浓度的增加呈现明显上调的趋势(P<0.05，P<0.01，图4)。

Fig. 3 Expression of NF-κB P65 mRNA in K562 cell*P<0.05，**P<0.01vsblank group

Fig. 4 Expression levels of protein P65, Fas, E-cadherin and β-catenin in the K562 cells A: P65; B: Fas; C: E-cadherin and β-catenin*P<0.05，**P<0.01vsblank group

3 讨论

现代研究表明：自由基是引起多种疾病和老化的主要原因；自由基能引起机体的许多连锁反应而后又经过体内代谢引起脂质、DNA、细胞膜等体内大分子损伤，这又是多种疾病，如癌症、心血管疾病、炎症等的诱因[5]，因此抗氧化剂的研究越来越受到重视。但由于市场上使用的多种抗氧化剂是化学合成的并且多具有不良反应，所以筛选能有效防御自由基损害的天然来源的抗氧化剂是目前研究的热点。

NF-κB P65作为核转录因子主要参与机体炎症、免疫反应、细胞增殖和凋亡过程的基因表达，在很多研究中都表明NF-κB P65与细胞增殖关系密切[6]。NF-κB通过上调抑制P53依赖的凋亡和上调Bcl-2家族抗凋亡成员和Caspase抑制剂如(XIAP和FILP)介导许多信号存活反应[7]；相反，NF-κB也被DNA损伤中的凋亡刺激所激活介导促凋亡基因(如TRAIL R2/DR5 以及Fas和Fas配体)上调[8]；在K562细胞中，加入苯酚类Ⅱ号药物后，核转录因子NF-κB P65的表达量明显上调，NF-κB P65作为核转录因子，它的激活受上游Ikk激酶和AKT激酶的调控[7]，下游受控制因子包括参与炎症、增殖、分化以及凋亡等相关因子，然而通过实时定量PCR以及Western blot实验表明NF-κB P65的表达在加入药物后明显上调，并且随着药物浓度的升高呈现明显的剂量效应关系。NF-κB不同的激活途径可引起不同的促凋亡蛋白(如FAS、C-MYC和P53)或抗凋亡蛋白(如TRAF2、IAP蛋白和BCL-2蛋白)的产生[8]；通过Western blot实验表明下游的Fas受体表达升高，可能是因为NF-κB P65参与了Fas的表达[9]，从而诱导了下游蛋白因子Caspase家族(半光天冬酶)的活化和激活，直接参与细胞凋亡。

黏附分子的表达或功能的改变被认为参与了癌症的进展，大多数肿瘤源自于上皮组织并且 E-cadherin 对上皮组织的组织构成至关重要。研究表明：在肿瘤进展过程中，发生了E-cadherin 介导的细胞与细胞黏附的缺失，这也是随后的肿瘤扩散或转移所需要的条件。由于癌症患者主要的死亡原因是肿瘤细胞转移性的扩散，因此，许多研究集中在肿瘤细胞转移性过程中的细胞黏附及信号转导机制[10]。E-cadherin是一类粘蛋白家族，参与由钙依赖的细胞与细胞之间的粘连，它保持细胞结合在一起以维护组织的完整性，这种跨膜连接丝蛋白含有胞外结构域，可以结合另一个细胞的钙粘蛋白，钙粘蛋白也有胞内结构域，可以结合连环蛋白(catenin)家族的连接丝蛋白[11]，连环蛋白家族蛋白能结合肌动蛋白的细胞骨架，作为细胞质内部的脚手架。因此当两个细胞经钙粘蛋白联系在一起时，肌动蛋白细胞骨架也间接连接。然而，β-catenin存在于细胞的三个不同区域：细胞膜粘连连接处、游离细胞质、细胞核中。β-catenin是粘连系统的主要组成成分，同时也是Wnt/β-catenin信号通路的关键激活因子，能与E-cadherin形成复合物从而参与细胞与细胞之间的粘附[12]。通过Western blot实验测得二者的表达量均上调，说明二者参与了细胞之间的粘附，说明苯酚类药物使得两种因子的表达上调促进了细胞之间的粘附，这对抑制肿瘤的迁移与扩散具有重要的意义。然而β-catenin是否参与了Wnt/β-catenin信号通路目前还不太清楚，但是也不能排除β-catenin在胞质内积聚，转而入核与转录因子TCF/LEF结合激活下游靶基因的表达[13]。本实验的研究结果表明苯酚类Ⅱ号药物诱导上游NF-κB P65、FAS、β-catenin和 E-cadherin的表达促进了肿瘤细胞的凋亡，增加了细胞间的粘附，对防止肿瘤细胞的扩散具有重大意义。

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A study involving antioxidizability and cytotoxicity of two kinds of phenol from Ajania Salicifolia and their mechanisms of apoptosis

ZHANG Wei1,2, WU Hong-ru4， LIANG Qiang-kun1, LI Yun-xia1, LU Yan-yu2, LONG Yao2, ZHU Ying4, LI Hong-fang1,2,3△

(1. Department of Physiology, College of Basic Medicine, 2. Key Laboratory of Preclinical Study for New Traditional Chinese Medicine of Gansu Province, 3. Functional Laboratory of Medicine, 4. State Key Laboratory of Applied Organic Chemistry, Lanzhou University, Lanzhou 730000, China)

Objective: To extract two kinds of phenols 4- hydroxy-3,5-dimethoxy-4-(2-oxopropyl)cyclohexa-2,5-dien-1-one and 6-methoxy-5,7-dihydroxy coumarin (named as Ⅰ and Ⅱ compounds respectively) from Ajania salicifolia and to investigate their antioxidation and cytotoxicity to tumors and explore their pro-apoptosis mechanism. Methods: The antioxidant activities of two compounds were assessed by ABTS and DPPH radical-scavenging assays. Two compounds were evaluated for their cytotoxicity against human chronic myelogenous leukemia (K562) cells using the MTT assay. The expression of NF-κB P65 mRNA in K562 apoptotic cells was measured by reverse transcription-polymerase chain reaction (RT-PCR), real-time quantitative PCR. In addition, protein expression levels of the NF-κB P65, p-Akt, Fas, β-catenina and E-cadherin were also measured by Western blot. Results: ① We found that compound Ⅰ displayed significant inoxidizability, while compound Ⅱ had no obvious antioxidizability. ② In cytotoxicity experiments, compound Ⅰ didn’t display cytotoxicity while compound Ⅱ displayed obvious cytotoxicity. ③ Compared with the blank group, the expression of NF-κB P65 mRNA in K562 cell after treatment with compound Ⅱ was obviously up-regulated. ④ Compared with the blank group, the expression levels of NF-κB P65, Fas, β-catenina and E-cadherin were significantly increased in compound Ⅱ treated groups and it appeared obvious dose-effect relationship between the expression of protein and drug concentration. Conclusion: Two phenols have obvious antioxidizability and cytotoxicity respectively. On the one hand, the tumor-suppressing mechanism of compound Ⅱmaybe act by up-regulation the expression of NF-κB P65 and Fas protein; thereby, affecting the classical Fas apoptosis signaling pathways.On the other hand,it can also up-regulate the expression of protein β-catenin and E-cadherin, which participate in the adhesion between cells, and accordingly, playing an important role in preventing the proliferation and metastasis of cancer cells.【KEY WORDS】 phenolcompounds； inoxidizability； cytotoxicity； NF-κB P65； Fas； β-catenin； E-cadherin

国家自然科学基金资助项目(21272103)

2014-12-29 【修回日期】2014-12-25

R730.53

A

1000-6834(2015)05-422-05

10.13459/j.cnki.cjap.2015.05.011

△【通讯作者】Tel： 0931-8289019； E-mail： Lihf@lzu.edu.cn