应用iTRAQ结合质谱技术筛选冷应激大鼠血浆差异表达蛋白*

刘艳芝， 郭景茹， 彭梦玲， 马 莉， 甄 莉， 计 红， 杨焕民

(黑龙江八一农垦大学动物科技学院， 大庆 163319)



应用iTRAQ结合质谱技术筛选冷应激大鼠血浆差异表达蛋白*

刘艳芝， 郭景茹， 彭梦玲， 马 莉， 甄 莉， 计 红， 杨焕民△

(黑龙江八一农垦大学动物科技学院， 大庆 163319)

目的：应用同重同位素相对与绝对定量(iTRAQ)结合质谱技术筛选冷应激大鼠血浆差异表达蛋白。方法：将30只健康SPF级雄性Wistar大鼠随机分为冷应激组A和常温饲养组B，将A、B两组分别随机分为3组，即A1、A2、A3组和B1、B2、B3组(n=5)。常温饲养温度为(24.0±0.1)℃，冷应激温度为(4.0±0.1)℃。两组实验大鼠经不同温度处理12 h后，用肝素钠抗凝负压管腹主动脉采血，分离血浆，提取血浆蛋白、定量、酶解、iTRAQ标记、强阳离子交换色谱(SCX分离)和质谱分析。结果：共鉴定出1 085个蛋白，筛出39个差异表达蛋白，其中29个表达上调蛋白，10个表达下调蛋白。经生物信息学分析，筛出3个与动物冷应激相关的重要差异表达蛋白，分别为：组织相容性蛋白HA-1、Ras相关蛋白Rap1b、整合蛋白β-1。结论：本实验成功筛出冷应激大鼠血浆差异表达蛋白，iTRAQ技术为筛选大鼠冷应激蛋白诊断标志物提供了一个良好的平台，为深入研究动物冷应激发生机制奠定了良好基础。

冷应激；大鼠；iTRAQ；差异表达蛋白

应激反应最早是由Hans Selye提出[1]，它是一种动物生理反应的基本现象。冷刺激是寒区常见的应激原之一，它可使畜产品质量降低，动物死亡率增加，给寒区畜牧业造成巨大损失。冷应激可使动物产生一系列复杂的生理调节反应，如对动物的生产性能、生理免疫、抗氧化功能、血液中部分生化指标等造成影响[2]。畜牧业发达国家早已高度关注动

物应激问题[3]。近年来国内学者也逐渐开始重视动物应激发生机制的研究。尽管应激研究取得了许多进展，但应激的评估指标、方法及其发生机理并未取得实质性的成果。国内外科研工作者针对动物应激的研究仅着眼于单个或少数几个分子的作用，缺乏在蛋白质水平的系统性、整体性的研究，且尚无公认的应激诊断标志物，故限制了应激发生机制的深入研究，也给动物与人类应激疾病的临床诊断带来了困难。

同重同位素相对与绝对定量技术(isobaric tags for relative and absolute quantitation，iTRAQ)是美国应用生物系统公司在2004年推出的一项新的体外同位素标记技术[4]。它可以同时对多种不同样本中的蛋白质进行定量比较，可对正常与疾病、治疗前后、疾病发展过程、细胞培养的不同状态下蛋白质表达的质和量的变化进行研究[5]。本研究旨在应用iTRAQ结合质谱技术，筛选冷应激大鼠血浆差异表达蛋白，通过生物信息学分析筛出在冷应激中起调控作用的重要差异蛋白，并进一步探索它们在冷应激发生机制中的关键作用，同时为进一步筛选大鼠冷应激的蛋白诊断标志物奠定理论基础。

1 材料与方法

1.1 主要仪器

Triple TOF 5600液相色谱电离串联质谱(AB SCIEX)；LC-20AB液相系统(岛津公司)；4.6×250 mm型号的Ul tremexSCX柱；低温高速离心机(Eppendorf 5430R)；600 V电泳仪(GE Healthcare EPS601)。

1.2 试验动物和分组

选用12周龄，体重(340±20)g的健康SPF级雄性Wistar大鼠30只，购自北京维通利华实验动物技术有限公司。试验前将大鼠进行单笼饲养，均按标准采食量饲喂和自由饮水预饲1周。将大鼠随机分为2组，分别为冷应激组A和常温饲养组B。为了减小实验误差，增加技术重复，将A、B两组分别随机分为3组，即A1、A2、A3组和B1、B2、B3组，每组各5只大鼠，冷应激时将每组单笼饲养的5只大鼠放在同一室内同时刺激。冷应激温度为(4.0±0.1)℃，常温饲养温度为(24.0±0.1)℃，光照按12 h标准昼夜交替，冷应激时间为12 h。冷应激试验均在人工智能气候室进行。

1.3 样品的采集和处理

经12 h冷刺激后(冷刺激时间为晚20∶00至次日早8∶00)，于次日早8∶00同时将冷应激组与常温饲养组的大鼠从人工智能气候室中取出，采用浓度为1.5%的戊巴比妥钠溶液，按0.2 ml/100 g体重的剂量对大鼠进行麻醉。使用肝素钠抗凝负压管采集大鼠腹主动脉血液；采集的血液3 000 r/min离心10 min；分离血浆于15 ml离心管中，用封口膜密封，冻存于-80℃冰箱以备用。

1.4 蛋白质提取及浓度测量

将A1、A2、A3和B1、B2、B3各组组内的每5个样品各取200 μl血浆等体积混合成一个样本，各取20 μl血浆样品，加1 ml冷丙酮沉淀过夜，4℃条件下25 000 r/min离心15 min，去上清，风干后加300 μl蛋白裂解液复溶，冰浴超声5 min后，4℃下25 000 r/min离心15 min，取上清，即为蛋白原样。使用Bradford定量法对蛋白浓度进行测量。从蛋白原样中精确取出20 mg用Protein Enrichment Large-Capacity Kit富集蛋白；加入终浓度为10 mmol/L的DTT，56℃水浴1 h；加入终浓度55 mmol/L的IAM暗室静置45 min；加入5倍体积的冷丙酮，-20℃沉淀蛋白液过夜；4℃条件下25 000 r/min离心20 min，除上清；风干沉淀中残余丙酮后，加300 μl蛋白裂解液复溶，冰浴超声5 min后，4℃下25 000 r/min离心15 min，取上清，即为富集后的蛋白样品。使用Bradford定量法对蛋白浓度进行测量。

1.5 SDS电泳

配置浓度为12%的SDS聚丙烯酰胺凝胶。将A1、A2、A3和B1、B2、B3每个样品分别与4×loading buffer混合，95℃加热5 min。每个样品上样量为30 μg，Marker上样量10 μg。120 V恒压电泳120 min。然后用考染液染色2 h，脱色液脱色3～5次，每次30 min。

1.6 蛋白质酶解

从富集好的A1、A2、A3和B1、B2、B3每个蛋白样品中精确取出100 μg蛋白；蛋白与酶按20∶1的比例加入胰蛋白酶(Trypsin)，37℃酶解4 h；上述比例再补加Trypsin一次，37℃继续酶解8 h。

1.7 iTRAQ标记、SCX分离及液相串联质谱分析

胰蛋白酶消化后，用真空离心泵抽干肽段；0.5 mol/L TEAB复溶肽段，按照手册进行iTRAQ标记；一组肽段被不同的iTRAQ标签标记，室温培养2 h；标记后的各组肽段混合。采用岛津LC-20AB液相系统、分离柱为4.6×250 mm型号的Ultremex SCX柱对样品进行液相分离。分离后样品经Triple TOF 5 600的液相色谱电离串联质谱(LC-ESI-MSMS)分析采集数据。

1.8 数据分析

1.8.1 原始质谱数据分析 质谱原始文件转换成mgf格式后被使用，mgf文件主要包含了二级质谱(MS/MS)谱图的信息。本次使用的数据库是Uniprot_RAT(34908sequences)，然后应用Mascot以mgf为原始文件，选择建立好的数据库，进行数据库搜索，对蛋白质进行鉴定。依据蛋白质丰度水平，当差异倍数(Ratio值)大于1.2倍或小于1.0，且经统计检验其P-value值小于0.05时，视为冷应激组与常温饲养组之间的表达上调或下调差异蛋白。

1.8.2 生物学功能分析 将筛选出来的血浆差异表达蛋白进行以下3种生物学功能分析：以KEGG Pathway为单位，应用超几何检验，找出在差异蛋白中显著性富集的Pathway富集分析；找出差异蛋白中显著富集的GO功能条目，从而给出差异蛋白质与哪些生物学功能显著相关的GO富集分析；预测差异蛋白可能的功能并对其做功能分类统计的COG分析。

2 结果

2.1 差异表达蛋白统计

本实验共鉴定到了1 085个蛋白质，以差异倍数大于1.2或小于1.0，且经统计检验其P-value值小于0.05时，视为差异表达上调或下调蛋白的标准。通过分析，共鉴定到39种差异表达蛋白，其中表达上调的差异蛋白29种(表1)，表达下调的差异蛋白10种(表2)，其中有些蛋白重复出现不同的亚型，功能相近，说明差异蛋白筛选结果比较理想。

Tab. 1 Up-regulated proteins between cold stress and control group of rat

GroupIDRatioGlyceraldehyde-3-phosphatedehy-drogenaseP047971.251Myl6proteinQ641191.448333333Myosin-9Q8VDD51.271333333Proteindisulfide-isomeraseA6Q630811.299333333Fermitinfamilyhomolog3,Q8K1B81.273666667Minorhistocompatibilitypro-teinHA-1Q3TBD21.607666667Integrinalpha-IIbQ9QUM01.368666667ATP-dependent6-phospho-fructokinase,platelettypeP478601.710666667IgheavychainVregionT601P018081.607666667CreatinekinaseM-typeP073101.83Integrin-linkedproteinkinaseO552221.407Glycoprotein5,plateletO087701.885RasGTPase-activatingprotein3Q9QYJ21.383666667COP9signalosomecomplexsubunit5O358641.268Coronin-1AQ91ZN11.367333333Integrinbeta-1P491341.292FetubproteinQ9QX791.625ProteinIghv13-1(Fragment)P018011.477333333Alpha-actinin-1Q9Z1P21.337333333cAMP-dependentproteinki-nasetypeII-betaregulatorysubunitP123691.257333333Plastin-2Q612331.416333333Ras-relatedproteinRap-1bQ626361.436666667Myl9proteinQ9CQ191.546333333FilaminalphaQ8BTM81.583Tubulinbeta-2AchainQ4R5B31.266333333Nidogen-1P084601.199666667Alpha-2-antiplasminQ612471.237666667VaspproteinP704601.401666667cGMP-specific3',5'-cyclicphos-phodiesteraseO547351.317

ID is the “Uniprot_Swissprot Accession” of a protein in Uniprot _RAT(34908sequences).Some uncharacterized protein are searched again in the database

Tab. 2 Down-regulated proteins between cold stress and control group of rat

GroupIDRatioSecretedphosphoprotein24Q627400.879666667Isoform2ofMurinoglobulin-1Q036260.768hepatictriacylglycerollipaseP078670.902333333Napsin-AO090430.807666667coagulationfactorXIID3ZTE00.814333333beta-galactosidealpha-2,6-sia-lyltransferase1P137210.884333333IgkappachainV-VIregionXRPC44P016750.655333333GbaproteinP174390.652alpha-2-macroglobulinP062380.585Iggamma-2BchainCregionP207610.749666667

2.2 生物学功能分析

经Pathway富集分析，冷应激组与常温饲养组之间的差异蛋白最显著富集的两条pathway通路是黏着斑通路(focal adhesion)和白细胞跨内皮细胞迁移(leukocyte transendothelial migration)，其中MAPK信号通路(MAPK signaling pathway)存在于以上两个pathway中。显著富集于黏着斑通路中的10个差异蛋白分别是：组织相容性蛋白HA-1(minor histocompatibility protein HA-1，PI3K)、Ras相关蛋白Rap1b(Ras-related protein Rap-1b，Rap1)、整合蛋白β-1(integrin beta-1，ITGB)、整合蛋白2b(integrin alpha-IIb，ITGA)、α辅肌动蛋白1(Alpha-actinin-1，actinin)、细丝蛋白α(filamin alpha，Filamin)、铁蛋白家族同族体3(fermitin family homolog 3,Talin)、血管扩张刺激磷蛋白(Vasp protein ,VASP)、整合素连接激酶(integrin-linked protein kinase,ILK)、肌球蛋白轻链6(Myl6 protein,MLC)；显著富集于白细胞跨内皮细胞迁移中的6个差异蛋白，分别是：ITGB、PI3K、Rap1、MLC、VASP、actinin；显著富集于MAPK信号通路中的3个差异蛋白，分别是：Rap1、filamin、PI3K。经研究发现，这3个代谢通路均与冷应激反应密切相关。其中，PI3K、Rap1和ITGB在这3个显著性富集的pathway中重复出现，并在其中发挥关键作用。GO富集分析结果排名前三的分别是：分子功能为整合(46.15%)、催化活性(26.15%)、酶调节(12.31%)；所处的细胞位置为细胞器(11.52%)、高分子复合物(9.42%)、细胞膜(7.33%)；参与的生物过程为单一生物过程(8.72%)、生物调节(8.14%)、刺激反应(8.14%)。经COG分析差异蛋白的功能主要包括：通用功能预测(28.13%)、细胞骨架(23.53%)，细胞周期调控、细胞分裂与染色体分区(9.38%)，信号转导机制(12.5%)，糖类运输和代谢(6.25%)。

3 讨论

比较蛋白质组学是近几年发展起来的功能强大的组学技术之一，它可以用来寻找差异表达蛋白质，这些蛋白质既可以为生理病理机理研究提供线索，又可以为相关诊断提供分子标志物。目前，比较蛋白质组学研究已逐步应用到动物应激反应的研究中，热休克蛋白70、解耦联蛋白、金属硫蛋白、冷诱导RNA结合蛋白等应激蛋白研究较多，但至今并未确定哪种蛋白在应激反应中发挥关键调控作用。在蛋白质组学研究中应用的比较成熟的定量方法主要有两种：一种基于传统双向凝胶电泳及染色，另一种基于质谱检测iTRAQ技术。而iTRAQ技术的主要优点有：定量敏感、反应速度快；标记完全，标记效率高达97%以上；较高的重复性，能简化谱的复杂程度、提高离子强度；可对多达八种不同样本同时进行定量分析；定性与定量同时进行。所以本研究采用iTRAQ技术筛选冷应激大鼠血浆差异表达蛋白，并通过pathway、GO和COG分析差异表达蛋白在冷应激发生、发展中发挥的关键作用。

通过生物信息学分析，在所获得的差异表达蛋白中，PI3K、Rap1和ITGB这3种差异表达蛋白与动物冷应激密切相关。本实验pathway富集通路之黏着斑通路中包含MAPK信号通路，MAPK家族信号通路又包括4条代谢途径，其中一条JNK途径存在于大多数细胞内，其作用过程涉及多层次的细胞调节，对生理、病理刺激(包括冷应激)可做出不同反应，同时其可将细胞外刺激信号转导至细胞核内，并引起细胞增殖、分化、转化、凋亡等生物学反应[6-10]。也有研究发现，应激、细胞因子、生长因子、神经酰胺等因素能激活JNK，JNK激活后的效应主要与细胞应激和细胞凋亡有关[11]。PI3K、Rap1和ITGB存在MAPK信号通路中的JNK途径中，即ITGB-FAK-PI3K-PIP3-Vav-Rac-JNK和ITGB-FAK-p130Cas-Crk-GRF2 -Rap1-JNK。其中，ITGB是整合蛋白的一个亚基，是一种跨膜蛋白，可与细胞外基质、血浆蛋白和细胞表面分子连接，促使黏着斑的形成。ITGB激活FAK后，继续激活PI3K和Rap1，进而激活JNK途径对细胞黏附和迁移、增生和分化及凋亡产生影响[12]，继而在冷应激的生理反应中发挥作用。三种蛋白均为差异上调蛋白。如上所述，它们均会促进黏着斑通路形成，积极参与冷应激反应，也充分验证了MAPK信号通路和黏着斑通路与冷应激发生机制有密切关系。

冷应激会导致机体发生炎症，各种炎症细胞在致炎因素的刺激下，需要从外周血管迁移到炎症部位或到次级淋巴组织，发挥杀伤病原微生物等炎症细胞趋化作用。炎症细胞需要克服的第一道屏障就是血管内皮细胞层或淋巴管内皮细胞层，即白细胞内皮迁移。而白细胞跨内皮细胞迁移是本实验差异蛋白显著富集的一个代谢途径之一。其中PI3K、Rap1和ITGB在此途径中参与的通路过程为：Gi-PI3K-TEC-Vav-Rac2和Gi-EPAC-Rap1-ITGAL/ITGB2-Pyk2-Vav-Rac2。迁移的第一步是形成板状伪足，其形成主要受Rac调节。研究表明Gi通过PI3K途径激活Rac。Rac在被Gi激活时必需有PI3K的参与，抑制PI3K的活性将阻止Rac的顺利激活，所以差异表达上调的PI3K在此途径中发挥促进白细胞跨内皮细胞迁移的至关重要作用。而Rap1参与包括细胞生长、分化、肥大、增殖以及上皮向间充质转化等过程[13]，Rap1在内皮迁移与血管生成的作用相对明确，Rap1缺失可以导致血管生成、内皮细胞迁移及增殖的功能受损以及MAPK信号通路的受阻[14]。ITGB在此代谢途径中的作用同黏着斑通路，促使黏着斑形成，黏着斑的形成有助于信号传导以及细胞骨架的重组，促进细胞迁移。进而在冷应激的炎症反应中发挥重要作用。

综上所述，本实验应用iTRAQ结合质谱技术成功筛选冷应激大鼠血浆差异表达蛋白，通过生物信息学分析选出在冷应激中发挥调控功能的差异蛋白PI3K、Rap1和ITGB，并进一步探讨了它们在代谢途径中的重要作用，且发现本试验促进了冷应激发生机制的深入研究，也为进一步筛选大鼠冷应激的蛋白诊断标志物奠定了良好的理论基础。

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Screening differentially expressed plasma proteins in cold stress rats based on iTRAQ combined with mass spectrometry technology

LIU Yan-zhi, GUO Jing-ru, PENG Meng-ling, MA Li, ZHEN Li, JI Hong, YANG Huan-minΔ

(College of Animal Science and Technology, Heilongjiang Bayi Agricultural University, Daqing 163319, China)

Objective: Isobaric tags for relative and absolute quantitation (iTRAQ) combined with mass spectrometry were used to screen differentially expressed plasma proteins in cold stress rats. Methods: Thirty health SPF Wistar rats were randomly divided into cold stress group A and control group B, then A and B were randomly divided into 3 groups(n=5): A1,A2,A3 and B1,B2,B3.The temperature of room raising was(24.0±0.1)℃, and the cold stress temperature was(4.0±0.1)℃. The rats were treated with different temperatures until 12 h. The abdominal aortic blood was collected with heparin anticoagulation suction tube. Then, the plasma was separated for protein extraction, quantitative, enzymolysis, iTRAQ labeling, SCX fractionation and mass spectrometry analysis. Results: Totally, 1 085 proteins were identified in the test, 39 differentially expressed proteins were screened, including 29 up-regulated proteins and 10 down-regulated proteins. Three important differentially expressed proteins related to cold stress were screened by bioinformatics analysis (Minor histocompatibility protein HA-1, Ras-related protein Rap-1b, Integrin beta-1). Conclusion: In the experiment, the differentially expressed plasma proteins were successfully screened in cold stress rats. iTRAQ technology provided a good platform to screen protein diagnostic markers on cold stress rats, and laid a good foundation for further study on animal cold stress mechanism.

cold stress; rat; iTRAQ; differentially expressed proteins

国家自然科学基金项目(31372398)；黑龙江省自然科学基金面上项目(C2015041)

2015-01-07 【修回日期】2015-03-02

S852.21

A

1000-6834(2015)05-392-05

10.13459/j.cnki.cjap.2015.05.003

△【通讯作者】Tel: 0459-6819201; E-mail: yanghuanmin@aliyun.com