短链氯化石蜡暴露对HepG2细胞代谢的影响

耿柠波，张海军，张保琴，王菲迪，任晓倩，陈吉平,*

1.中国科学院大连化学物理研究所，大连 116023 2.中国科学院大学，北京 100049

短链氯化石蜡暴露对HepG2细胞代谢的影响

耿柠波1,2，张海军1,#，张保琴1，王菲迪1,2，任晓倩1,2，陈吉平1,*

1.中国科学院大连化学物理研究所，大连 116023 2.中国科学院大学，北京 100049

短链氯化石蜡(short-chain chlorinated paraffins,SCCPs)是一组成分复杂的氯代正构烷烃，在环境中普遍存在。然而有关其毒性机理的信息十分有限，限制了对其健康风险的评估。本研究采用液相色谱-串联质谱(LC-MS/MS)分析技术，研究了不同剂量的SCCPs暴露(0、1.0、10.0和100.0 μg·L-1；C13-CPs；55.0% Cl)对人体肝癌细胞HepG2的糖代谢、氨基酸代谢和脂肪酸代谢的影响。通过偏最小二乘判别分析(PLS-DA)鉴别各组代谢产物谱差异，发现3个SCCPs暴露剂量组均能够与对照组完全分开，表明SCCPs短期暴露能够引起细胞代谢活动的显著改变。SCCPs的低剂量暴露可明显刺激HepG2细胞对氨基酸的吸收。与对照组相比，SCCPs低剂量暴露组(1.0 μg·L-1)培养基中谷氨酰胺、色氨酸和丝氨酸的含量显著(P<0.05)降低。而高剂量SCCPs(100.0 μg·L-1)暴露抑制了细胞对氨基酸和葡萄糖吸收，但促进了乳酸、丙氨酸、半胱氨酸的生成。氨基酸吸收的抑制不可避免地会影响蛋白质的合成。同时，SCCPs的暴露使饱和脂肪酸代谢紊乱，使不饱和脂肪酸水平上调。为确定SCCPs的毒性作用方式，有必要从转录组和蛋白组层面进一步研究其毒性机制。

SCCPs；HepG2；代谢物；氨基酸代谢；脂肪酸代谢

SCCPs对器官组织功能、酶活性和内分泌的一系列影响可灵敏地反映在对生物体氨基酸、脂肪酸、糖和其他小分子化合物代谢的影响。近年来。随着生物体代谢物数据库的不断完善，以及小分子代谢物生物学特性研究的不断发展，从代谢层面对环境污染物的毒性进行研究更具有生物学意义。目前尚没有涉及SCCPs对生物体代谢影响的研究。本实验选择人肝癌细胞HepG2为受试细胞，探讨了环境浓度SCCPs暴露对细胞小分子代谢物的干扰作用，通过对糖代谢、氨基酸和脂肪酸代谢干扰的评估，在代谢组层面揭示SCCPs的毒性效应。

1 材料与方法(Materials and methods)

1.1 实验材料

细胞培养基(DMEM)和胎牛血清(FBS)购自美国Gibco公司，青霉素-链霉素购自Hyclone 公司(Logan,UT)。MTT (3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴盐)购自美国AMRESCO公司，纯度>98%；二甲基亚砜(DMSO)和甲醇等其他化学试剂均为国产色谱纯试剂。脂肪酸、氨基酸、乳酸、尿素、葡萄糖和甘油等标样、以及甲基叔丁基醚(MTBE)购自阿拉丁试剂公司。色谱纯乙酸铵和甲酸购自百灵威公司。色谱纯乙腈和甲醇购自Fisher公司(Fair Lawn,NJ,USA)。所有的实验用水均为来自Milli-Q系统的超纯水(Millipore,Billerica,MA,USA)。所用SCCPs为C13-CP，氯含量为55%，在实验室通过烷烃氯化反应得到[13]。

1.2 受试生物

HepG2细胞购自中国科学院上海生命科学研究院生物化学与细胞生物学研究所。细胞培养所用培养基为含有10%胎牛血清，1%双抗的DMEM (体积分数)。取对数生长期的细胞，用胰蛋白酶消化后，将细胞数调整到3×105细胞每孔，种植于6孔培养板中，置于培养箱内(37 ℃,5% CO2)培养。待6孔板铺满80%后吸弃原培养基，换上含有SCCPs的培养基培养24 h。SCCPs通过溶于DMSO引入细胞培养液，DMSO在培养基中的最终含量为0.05%(体积分数)，4个剂量组SCCPs含量分别为0、1.0、10.0和100.0 μg·L-1，每组设6个平行样，对照组只加入体积分数为0.05%的DMSO。

1.3 实验仪器

Galaxy 48 R型CO2培养箱(美国New Bruns-wick公司)，Tecan多功能酶标仪(Tecan Genesis，瑞士)，Biofuge©Stratos全能台式高速冷冻离心机(德国Heraeus公司)，TSQ-QuantumMax高效液相色谱串联质谱 (HPLC-MS/MS) (美国Thermo公司)。

1.4 实验方法

当然，我的这种揣测都是短暂的，每每此刻，我都会调整自己，不过是游戏罢了，他在我身上享受到了满足，我从他那儿得到了拥有金钱的满足感，何乐不为？何苦还要来思量爱与不爱，爱顶个屁用。

代谢物提取参考Whiley等[14]建立的小分子代谢物提取方法。细胞暴露24 h后，将细胞培养液移至2 mL离心管中，6 000 g × 4 ℃条件下离心10 min，取上清液200 μL冻干，加入400 μL MTBE室温条件下涡旋提取20 min；然后加入260 μL超纯水混匀，10 000 g × 4 ℃条件下离心15 min，取上清350 μL于样品管中氮气吹干，用350 μL乙腈复溶，经过0.22 μm滤膜过滤后用于非极性组分的分析。剩余部分用于极性组分的提取，依次加入100 μL MTBE和130 μL甲醇。室温条件下涡旋20 min，10 000 g × 4 ℃条件下离心15 min，提取体系明显分层，上层为MTBE相，下层为甲醇-水相。从下层甲醇-水相中取200 μL经过0.22 μm滤膜过滤后，直接用于极性组分的分析。提取前于样品中加入10 μL混合内标(正亮氨酸，十一酸和十九酸，浓度分别为200，54和34 μmol·L-1，溶剂为乙腈)。

游离脂肪酸组分的分析采用的色谱柱为Ufavour C8柱(150 mm×2.1 mm,3.0 μm)；流动相A为H2O，B为5 mmol·L-1乙酸铵的乙腈，C为乙腈；流动相梯度为(时间，B%，C%，流速)：0～5 min，20% B，70% C，250 μL·min-1；7～15 min，20% B，80% C，250 μL·min-1；16～20 min，20% B，70% C，300 μL·min-1；柱温箱温度为40 ℃，进样量为10 μL。质谱扫描模式为ESI(-)MRM。喷雾电压为2 500 V；辅助气为5 psi；鞘气为30 psi；整个分析过程在20 min内完成。游离氨基酸组分的分析采用Atlantis C18 高效液相色谱柱(waters,150 mm×2.1 mm,3.0 μm)；流动相A为0.5%甲酸的H2O，流动相B为甲醇；流动相梯度为：0～2 min，95%A和5%B；然后在3 min之内A减少为40%，B增加为60%，维持4 min；在1 min内A增加到95%，维持8 min，总流速为200 μL·min-1，进样量为2 μL。质谱扫描模式为ESI(+)MRM。喷雾电压为3 000 V；辅助气为5 psi；鞘气为30 psi；整个分析过程18 min内完成。

表1 极性组分分析的MS/MS参数Table 1 The MS/MS parameters for polar fraction analysis

表2 非极性组分分析的MS/MS参数Table 2 The MS/MS parameters for apolar fraction analysis

1.5 数据处理

利用Thermo fisher Xcalibur 2.1数据处理软件进行定量分析，SPSS18统计软件(SPSS Inc.,Chicago,IL)用于单因素方差分析(one way ANOVA)，实验组数据与对照组数据之间的比较采用最小显著差数法(LSD)，P<0.05被认为是显著性差异的数据，P<0.01表示差异极显著。偏最小二乘判别分析(PLS-DA)基于网络在线分析系统(http://www.metaboanalyst.ca/MetaboAnalyst/faces/Home.jsp)。

2 结果(Results)

2.1 小分子代谢产物的PLS-DA分析

为探讨SCCPs暴露是否对HepG2细胞带来影响。分别对不同剂量暴露组和对照组细胞的小分子代谢产物数据进行了PLS-DA分析，并建立包含第一个主成分(component 1)和第二个主成分(component 2)的二维空间模型，结果如图1所示。其中表示模型解释能力的参数R2=0.87，表示模型预测能力的参数Q2=0.65，表明该模型结果可靠，不存在过拟合现象。从图1可见，3个SCCPs暴露剂量组均能够与对照组明显区分开，表明SCCPs短期暴露能够引起细胞代谢活动的变化，使细胞小分子代谢物发生改变。在3个SCCPs暴露剂量组中，低剂量组(1.0 μg·L-1)和中剂量组(10.0 μg·L-1)在得分图上有明显的重合，但均能与高剂量组(100.0 μg·L-1)区分开，表明SCCPs对细胞小分子代谢物的干扰存在一定的剂量依赖性。

图1 SCCPs暴露组与对照组小分子代谢产物的PLS-DA得分图

2.2 小分子代谢产物的聚类分析

对22种显著变化的小分子代谢物进行聚类分析，结果如图2所示。细胞的代谢物主要表现出3种变化趋势。与对照组相比，大部分不饱和脂肪酸，以及半胱氨酸，丙氨酸，缬氨酸，乳酸和葡萄糖在SCCPs暴露组中呈现增加趋势。饱和脂肪酸，如癸酸(10:0)，十二烷酸(12:0)，十六烷酸(16:0)，十八烷酸(18:0)和二十烷酸(20:0)，随SCCPs暴露剂量的增加表现出非单调变化趋势；从低剂量组到中剂量组，饱和脂肪酸含量变化趋势为先降低后升高，当暴露剂量增加到100.0 μg·L-1，其含量出现反弹。第3组包括谷氨酸，苏氨酸，异亮氨酸，苯丙氨酸，丝氨酸，赖氨酸，色氨酸和谷氨酰胺，与对照组相比，这些代谢产物在低中高3个SCCPs暴露剂量组均呈现降低趋势。

在生物体内每种小分子代谢产物都参与多种代谢通路，受到胁迫后其含量的变化会呈现单调和非单调剂量效应关系，这一现象在代谢组学研究中多有报道[15]。在本研究中，随着SCCPs暴露剂量的增加，某些氨基酸和脂肪酸含量出现波动并表现出非单调剂量效应关系，暗示细胞在SCCPs的毒性作用下进行了自我调控。这可能是由于SCCPs的多个毒性作用通路共同作用的结果。另外，受到小剂量有害刺激后，细胞会产生预适应，在应激后一段时间内产生保护作用[16]，这也是细胞代谢波动的原因。

2.3 对细胞葡萄糖和氨基酸代谢的影响

图3显示了SCCPs暴露24 h后几个重要差异代谢物的浓度变化情况。其中葡萄糖、谷氨酰胺、色氨酸和丝氨酸为细胞培养基中添加的营养物质；乳酸、丙氨酸、谷氨酸和半胱氨酸为细胞合成物质；葡萄糖、乳酸和丙氨酸是糖酵解的中间代谢产物。与对照组相比，SCCPs高剂量暴露组的葡萄糖水平略有升高，意味着葡萄糖代谢被抑制。细胞中的乳酸绝大部分由葡萄糖通过糖酵解途径生成，另一方面，细胞中的其他氨基酸可以作为前体物质，间接生成乳酸。乳酸是细胞毒性的重要标志物，在本试验中，高剂量SCCPs的暴露使乳酸的生成量与对照组相比增加了1倍，增加的乳酸有可能对细胞造成了一定的毒性作用。另外，丙氨酸的水平在高剂量SCCPs暴露下也表现出显著增加。谷氨酰胺和谷氨酸是参与谷氨酰胺代谢的重要物质，谷氨酰胺通过谷氨酰胺酶生成谷氨酸，并进一步通过谷氨酸脱氢酶或转氨酶生成α-酮戊二酸进入三羧酸循环，为细胞提供中间代谢物质和能量。与对照组相比，谷氨酰胺水平在SCCPs中低暴露剂量组显著降低，说明中低剂量水平的SCCPs能够促进细胞对谷氨酰胺的吸收。但当SCCPs浓度增加到100.0 μg·L-1时，谷氨酰胺水平略有增加，表明高浓度SCCPs抑制了细胞对谷氨酰胺的吸收。随着SCCPs暴露剂量的增加，谷氨酸水平呈现轻微降低趋势；相反，半胱氨酸含量显著增加；而色氨酸和丝氨酸则先降低后增加。

图2 SCCPs暴露后22种差异代谢物的热图和聚类分析结果

图3 SCCPs暴露对HepG2细胞葡萄糖、乳酸和氨基酸代谢的影响

图4 SCCPs暴露对HepG2细胞脂肪酸代谢的影响

2.4 对细胞脂肪酸代谢的影响

如图4所示，不饱和脂肪酸含量在3个SCCPs暴露组均有上调。与对照组相比，十八碳一烯酸在SCCPs中剂量暴露组有显著增加，十八碳三烯酸在SCCPs中剂量和高剂量暴露组显著上调；而十八碳二烯酸和二十碳五烯酸的变化最为显著，即使在低剂量暴露组亦有显著增加。在3个暴露剂量组中，饱和脂肪酸的变化趋势比较一致，呈现先降低，后升高，最后下调的趋势。与对照组相比，癸酸(10:0)、十二烷酸(12:0)、十六烷酸(16:0)和十八烷酸(18:0)在低剂量暴露组均呈现显著降低，并且癸酸和十二烷酸在高剂量暴露组也有明显下降。脂肪酸含量的改变能够影响细胞生物膜的形成，对细胞的增殖分化产生不利作用。

3 讨论(Discussion)

到目前为止，对SCCPs的健康风险评估大多是基于对模式动物的毒理学暴露试验，体外细胞实验研究很少。已有研究发现，高浓度SCCPs的长期暴露对大鼠有致癌作用[17]，其对大鼠的无可见有害作用水平(NOAEL)为10 mg·d-1·kg-1[10]，但SCCPs在μg·L-1水平就对水生生物具有慢性毒性效应。Thompson等[18]研究了SCCPs (C10-13,58% C1)对糠虾(mysid shrimp)和大型蚤(Daphnia magna)的毒性作用，发现96 h的半数效应浓度分别为14和18 μg·L-1。本实验以HepG2细胞为研究对象，探讨了环境浓度水平SCCPs对细胞小分子代谢物的干扰作用。结果表明SCCPs暴露后，HepG2细胞小分子代谢物与对照组相比有明显的变化，细胞在糖代谢、氨基酸代谢和脂肪酸代谢方面发生不同程度的紊乱。

糖代谢和谷氨酰胺代谢是细胞能量的主要供应途径。葡萄糖和氨基酸消耗的分析结果表明，低剂量SCCPs可刺激细胞对多种氨基酸的吸收，而当暴露剂量增加到100.0 μg·L-1后，SCCPs会抑制细胞对培养基中葡萄糖、谷氨酰胺和多种氨基酸的吸收。葡萄糖通过糖酵解途径为细胞提供中间代谢物质和能量，同时可生成乳酸。谷氨酰胺可通过三羧酸循环为细胞提供中间代谢物质和能量。高剂量SCCPs暴露后，细胞对葡萄糖和谷氨酰胺消耗减弱，糖酵解和谷氨酰胺代谢可能被抑制，这一变化可能会造成细胞内能量供给不足，从而影响细胞的生长增殖和分化。同时，细胞对氨基酸的吸收和转化的变化会影响细胞内蛋白质的合成。本研究还发现，尽管糖酵解途径可能受阻，但乳酸的产生量却大量增加，此时细胞需要借助其他的途径产生过量的乳酸。乳酸是细胞毒害作用的重要标志物[19]，增加的乳酸会对肝癌细胞造成一定的毒性作用。这一结果与文献报道的二噁英对HepG2细胞代谢的干扰是一致的[20]。

脂肪酸类物质在细胞中的平衡对于稳定细胞膜功能、调控基因表达、维持细胞脂蛋白平衡和促进生长分化等方面起着重要作用。SCCPs的暴露使饱和脂肪酸水平紊乱，使不饱和脂肪酸水平上调，引起细胞脂代谢异常。由于动物细胞细胞膜的流动性主要依赖于不饱和脂肪酸的含量，细胞外不饱和脂肪酸含量随SCCPs暴露剂量的增加而增加；同时高剂量组饱和脂肪酸含量降低，表明SCCPs可能对细胞膜有损伤作用，导致细胞膜流动性降低，这可能是细胞运送营养物质功能降低的主要原因。SCCPs在生物体内与相关代谢降解酶相互作用会导致一定的氧化压力，脂肪酸代谢紊乱可能是氧化应激和脂质过氧化的结果。Warnasuriya等[21]在研究SCCPs肾毒性作用机制时发现，SCCPs能够作为一种过氧化物酶体增殖促进剂加速大鼠肾脏的过氧化物酶体增殖；Brunstrom等[22]研究发现，SCCPs能够影响小鸡胚胎中细胞色素P-450酶的含量和微粒体酶的活性；Darnerud[23]对老鼠进行SCCPs暴露后发现，SCCPs能够被细胞色素P-450酶代谢。细胞脂肪酸代谢的紊乱可能主要受PPAR信号通路的调控。Elcombe等[24]研究发现，SCCPs暴露后引起大鼠肝脏过氧化物酶体增殖，由于过氧化物酶体增殖活化受体(PPAR)能够调控肝细胞脂肪酸代谢相关基因的表达，本研究中细胞脂肪酸代谢的紊乱可能受PPAR信号通路的调控。在今后的研究中，应该从转录组和蛋白组层面追踪SCCPs干扰PPAR信号通路的分子机制。

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Effects of SCCPs Exposure on the Metabolism in HepG2 Cells

Geng Ningbo1,2,Zhang Haijun1,#,Zhang Baoqin1,Wang Feidi1,2,Ren Xiaoqian1,2,Chen Jiping1,*

1.Dalian Institute of Chemical Physics,Chinese Academy of Sciences,Dalian 116023,China 2.Graduate School of Chinese Academy of Science,Beijing 100049,China

7 March 2015 accepted 21 May 2015

Short chain chlorinated paraffins (SCCPs,C10-13) are a large and complex group of polychlorinated n-alkanes,and ubiquitously found in the environment.However,very limited information is available for their toxicity mechanism,limiting the evaluation of their health risks.In this study,liquid chromatography-tandem mass spectrometry (LC-MS/MS) was adopted to investigate the influence of SCCPs exposure with different doses (0,1.0,10.0 and 100.0 μg·L-1; C13-CPs; 55.0% Cl) on the metabolism of glucose,amino acids and fatty acids in human hepatoma HepG2 cells.The result of partial least squares discriminant analysis (PLS-DA) showed that all SCCPs exposure groups were clearly distinct from the control group,indicating a significant metabolic perturbation induced by SCCPs.Low-dose SCCPs exposure promoted the import of extracellular amino acids into cells.Compared with the control group,the contents of glutamine,tryptophan and serine in the culture medium of low-dose SCCPs exposure group (1.0 μg·L-1) were significantly decreased (P<0.05).However,the high-dose SCCPs exposure (100.0 μg·L-1) inhibited the transport of amino acids and glucose into cells,and significantly up-regulated the biosynthesis of lactic acid,alanine and cysteine.The disorder of amino acids metabolism would inevitably affect the protein biosynthesis.Meanwhile,SCCPs perturbed the metabolism of unsaturated fatty acids,and markedly up-regulated the contents of polyunsaturated fatty acids.In order to make sure the mode of action of SCCPs,transcriptomic and proteomic evidences on SCCPs toxicity should be further provided.

SCCPs; HepG2; metabolites; amino acid metabolism; fatty acid metabolism

国家“863”项目 (2013AA065203)；国家自然科学基金(21337002,21277141)

耿柠波(1985-)，女，博士研究生，研究方向为环境毒理学，E-mail: gengningbo@dicp.ac.cn；

*通讯作者(Corresponding author)，E-mail: chenjp@dicp.ac.cn

10.7524/AJE.1673-5897.20150307005

2015-03-07 录用日期：2015-05-21

1673-5897(2015)4-115-08

X171.5

A

陈吉平(1964)，男，分析化学博士，研究员，主要从事分析化学与环境化学及其相关的基础与应用研究，发表学术论文90余篇。

#共同通讯作者(Co-corresponding author),E-mail: hjzhang@dicp.ac.cn

耿柠波，张海军，张保琴,等.短链氯化石蜡暴露对HepG2细胞代谢的影响[J].生态毒理学报，2015,10(4): 115-122

Geng N B,Zhang H J,Zhang B Q,et al.Effects of SCCPs exposure on the metabolism in HepG2 cells [J].Asian Journal of Ecotoxicology,2015,10(4): 115-122 (in Chinese)